XVI век ознаменовался усилением шляхетской демократии в ущерб центральной королевской власти. Важным этапом на этом пути стала Радомская конституция 1505 г., названная «Nihil novi» («Ничего нового»), поскольку она устанавливала порядок, по которому король не мог проводить никаких инноваций без соизволения сейма. Король Сигизмунд I Старый (1506–1548) при поддержке средней шляхты попытался осуществить целый комплекс мероприятий («экзекуцию»), направленных на укрепление королевской власти: возврат королевских владений, переданных в залог магнатам, отмену устаревших законов, обложение военным налогом церковных земель. Однако более радикальные проекты короля, ущемлявшие интересы шляхты (постоянное налогообложение дворянских имений, содержание регулярного войска, превращение королевской власти из выборной в наследственную), не встретили поддержки и не были осуществлены. На сейме 1536 г. шляхта призвала к преобразованиям, направленным против светской и церковной олигархии, против короля, а также против городов (требование распустить цехи ремесленников в целях свободного сбыта продукции панских ремесленников из местечек). Взбунтовавшиеся шляхтичи в 1537 г. лишили сенат законодательных прав. В Польше сложилась прочная традиция вооруженного сопротивления (мятежи — рокоши и конфедерации) шляхты, недовольной политикой короля или же действиями другой шляхетской группировки. Громкие речи на сейме и буйное поведение шляхтичей неизбежно перерастали в вооруженные, хотя ограниченные, конфликты, пока еще не представлявшие опасности для польской государственности. Однако эта тенденция постоянно росла.
Начавший распространяться в Польше с 20-х годов XVI в. протестантизм (лютеранство, затем кальвинизм) был воспринят шляхтой в соответствии со своими сословными традициями: шляхтичей привлекало не столько религиозное содержание новых доктрин, сколько возможность использовать их в своих целях для укрепления независимости позиции дворянина. Строгая этика кальвинизма осталась чужда шляхте, сохранявшей по-славянски широкий и даже разгульный образ жизни, однако его тираноборческие идеи оказались весьма кстати на пути к шляхетской демократии. Борьба за свободу вероисповедания в Польше приняла характер традиционной борьбы за расширение шляхетских привилегий. Антипротестантские меры Католической церкви и короля не были поддержаны шляхтой и поэтому не имели значительных последствий. В стране установилась религиозная терпимость, зафиксированная государственным актом 1573 г. Определенную роль в этом процессе сыграл важнейший внешнеполитический успех Польши. Ее многовековой враг, Тевтонский орден, стал лютеранским княжеством Пруссией, в 1525 г. принесшим вассальную присягу польской короне.
Конфессиональное расслоение в Польше приобрело классовый характер: крестьянство осталось верным католицизму, рассматривая евангелические конфессии как «ересь панов». Среди части горожан распространялись радикальные ереси (антитринитаризм), особое значение приобрели Польские братья (ариане), которые создали замкнутую общину, придерживавшуюся «евангельских правил жизни». Польские братья вели культурно-образовательную деятельность, уделяя особое внимание созданию христианско-просветительской литературы на национальных языках.
С середины 60-х годов XVI в. Католическая церковь, реформированная Тридентским собором, начинает борьбу с протестантизмом в Польше. Во главе этого процесса, проходившего исключительно в мирных формах, стояли кардинал Станислав Гозий и приглашенные им иезуиты, которые внесли значительный вклад в ренессансную культуру страны. То, что Польша в XVI в., как Чехия и Венгрия, не знала религиозных войн, несмотря на конфронтацию королевской и сословной власти, можно объяснить именно силой дворянских сословий, которые решали религиозные вопросы самостоятельно, считая свободу совести делом каждого и гарантируя ее защиту как одну из сословных привилегий. Польша достигла наивысшего расцвета в правление Сигизмунда II Августа (1548–1572), что выразилось в широком распространении новой ренессансной культуры и усилении международных позиций.