В деятельности Ферраро-Флорентийского Собора, куда русская делегация прибыла уже после его начала, Исидор принимал заметное участие, однако не столько как богослов и интеллектуал, сколько как политик и практик. Несмотря на то, что на Соборе в Ферраре Исидор отстаивал точку зрения греков и выступал против дополнений к Символу веры, однако по вопросу исхождения Святого Духа он проявил себя сторонником латинского учения, что можно объяснить не только его желанием заключить унию любой ценой, но и, вероятно, тем убеждением, которое он высказал на Соборе: «…восточные отцы в равной мере приписывают, что Св. Дух происходит и от Сына; вот посему нам и следует на этом вопросе сойтись с Латинской Церковью». Мы видим, что во время Собора он практически не высказывается по поводу вероучительных моментов, которые могли быть ему либо безразличны (что с учетом его читательских интересов маловероятно), либо по той причине, что он этим различиям не придавал большого значения. Последнее обстоятельство можно объяснить тем, что во время Ферраро-Флорентийского Собора полноценно и красноречиво проявилась терпимость Исидора по отношению к латинянам, сформировавшаяся на Пелопоннесе и в результате полученного образования у известного латинофила Мануила Хрисолоры. Сложно сказать, что для Исидора играло первостепенное значение в заключении унии: радел ли он об утраченном единстве христианского мира, или его жгучее желание соединиться с латинянами любой ценой для получения военной помощи Византийской империи против турецкого нашествия было продиктовано его исключительным патриотизмом и нежеланием гибели Родины. Если принимать во внимание, что Исидор находился в особенной связи с монархией и мог находиться в родственных связях с домом Палеологов, на Соборе он мог последовательно проводить проуниатскую политику византийского императора Иоанна VIII Палеолога, не взирая на какие-либо ограничения, связанные с вероучительными вопросами. Учитывая вклад Исидора в организацию различного рода совещаний греческой делегации, визиты к императору, патриарху и Римскому папе, пропаганду латинского вероучения грекам, следует отметить его, наряду с митрополитом Виссарионом Никейским, главную роль в заключении унии.
Возвращение русской делегации обратно в Москву растянулось практически на полтора года. Киевский митрополит, ставший теперь и папским легатом в нескольких странах Восточной Европы, заезжал в разные города своей церковной области, однако уния на территории областей легатства Исидора была воспринята холодно и ему стоило огромных усилий «словами, делами и даже кровью» ее пропагандировать. Однако в Московском государстве, благодаря позиции великого князя Василия Васильевича Темного, который оказался человеком более чутким в отношении к вопросам веры, флорентийское соединение было решительно отвергнуто, и все попытки митрополита Исидора по насаждению унии на Руси оказались неудачны. Сам митрополит из-за своих действий Собором русских епископов был «сведен с митрополии» и, если доверять русским летописям, чуть было не лишился жизни. Отныне Русская Церковь будет постоянно помнить поступок Исидора как отступничество, а в отношении к греческим епископам будет проявлять настороженность, как к людям, чья верность православию может быть поставлена под сомнение. Именно поэтому спустя несколько лет, в 1448 г., Русская Церковь провозгласит свою автокефалию и теперь митрополиты Русской Церкви будут избираться из среды русского духовенства.