Посте отказа турки осадили родосскую крепость. Почти ежедневно рыцари делали вылазки. Турки попытались взять центральную крепостную башню святого Николая. После нескольких штурмов янычары даже ворвались на башню, но были с большими потерями выбиты оттуда. Рыцари с помощью десятков брандеров подожгли турецкий флот и янычары в беспорядке отступили.
Командующий турецкой армией Меши-паша, греческий принц из бывшей правящей династии Византийской империи Михаил Палеолог, попытался осадить крепость с другой стороны, где она была не так сильно укреплена. Д’Обюссон приказал вырыть за крепостью широкий и глубокий ров. Из разобранных городских домов в несколько дней была построена каменная стена, что сами турки считали невозможным. Штурм янычар был отбит и Меши-паша бросил все силы на взятие башни святого Николая. Осадная артиллерия сделала в башне пролом, в который бросились янычары. Турок встретили рыцари во главе с Великим Магистром и в кровопролитном сражении отбросили их. Осадная артиллерия несколько дней громила родосскую крепость, в которой не оставалось почти ни одного неразрушенного дома. На рассвете 27 июля турецкая армия атаковала рыцарей и заняла вал перед крепостью. Д’Обюссон развернул большое орденское знамя и обратился к рыцарям: «Вперед, братья, в сражение за веру защищать Родос, или погибнем в его развалинах!» Паша лично повел янычар в пролом башни святого Николая. В башне рыцари во главе с Пьером д’Обюссоном колонной, ощетиненной копьями, атаковали турок. В яростном бою Великий Магистр получил пять ран, но в тыл не ушел. Через несколько дней вся Европа повторяла его призыв к рыцарям в проломе башни святого Николая: «Лучше умрем здесь, чем отступим. Можем ли мы когда славнее за веру умереть!» Рыцарская атака вынесла турок из башни, родоссцы гнали их до самого лагеря. Из семидесяти тысяч Меши-паша потерял почти тридцать. 14 августа турецкая армия Родоса отплыла в Константинополь. Султан повесил многих военачальников и сослал бывшего Палеолога. По всем европейских странам прогремела слава Ордена иоаннитов. В европейских городах и дворах говорили, что неисчислимые вражеские силы были отражены горстью рыцарей, чье малое количество было во много раз увеличено изумительным мужеством и беспримерной неустрашимостью. В честь победы родосские рыцари построили три церкви в честь Богородицы и покровителей Ордена.
Новый поход на Родос в 1481 году решил возглавить победитель Византии султан Мехмед II, было собрано трехсоттысячное войско, но поход был прерван из-за смерти султана.
В 1484 году новый турецкий султан Баязид II, который больше не хотел ссориться с иоаннитами, поддерживавшими его конкурента и претендента на турецкий престол младшего брата султана, сделал им чрезвычайно ценный подарок. В дар Ордену была передана десница Иоанна Крестителя, покровителя Ордена.
По преданию, правая рука, десница Иоанна Предтечи была перенесена евангелистом Лукой из Севастии в Антиохию, откуда попала в Халкидон, в затем в Константинополь. После взятия столицы Византии турками в 1453 году, реликвия попала к султанам и была передана иоаннитам. После перенесения орденской резиденции на Мальту святыня хранилась в соборе города Ла Валетта.
К 1517 году войска турецкого султана Селима I взяли столицу Египта Каир и оккупировали всю страну. К 1520 году знаменитый итальянский инженер и фортификатор Б. Скала обновил и усилил все укрепления на острове. На Родос было завезено большое количество продовольствия и оружия из Сицилии. Гарнизон Родоса состоял из трехсот рыцарей и семи тысяч итальянских моряков, критских лучников и родоссцев. Крепость острова была самой современной в фортификационном отношении во всем христианском мире. В 1521 году великим магистром был избран Филипп де Филье де л’Илль – Адан.
Весной 1522 года турецкий султан Сулейман Великолепный отправил на завоевание Родоса огромную армию. Эскадра из четырехсот кораблей со стотысячной армией во главе с визирем Мустафа – пашой подошла к острову. За ней двигались еще сто тысяч турок. Султан не стал штурмовать крепость. Несколько штурмов в августе и сентябре были отбиты. Осадная турецкая артиллерия постоянно обстреливала родосские укрепления. 4 сентября турки разрушили два бастиона и ворвались в крепость, но были выбиты рыцарями во главе с Великим Магистром. Еще три месяца иоанниты отбивались от двухсоттысячной турецкой армии во главе с султаном. 17 декабря 1522 года начался отчаянный трехдневный штурм почти разрушенной крепости. 20 декабря Родос согласился на почтенную капитуляцию, принятую Сулейманом Великолепным, за полгода осады потерявшим сто тысяч солдат: