Так же, в церкви, обычно принимали в члены Ордена простых рыцарей. Одетый в длинную одежду без пояса кандидат становился перед алтарем на колени и просил о принятии в Орден иоаннитов, мальтийских рыцарей. Ему давали в руки белую восковую горящую свечу, которая означала любовь к Богу и ближнему. Во имя Отца и Сына и Святого Духа кандидат принимал позолоченный меч для защиты католической веры, отражения и усмирения неприятелей, прощения покорившихся, и предоставления себя самого, в случае необходимости, за веру на смерть. Его опоясывали шарфом в знак хранения целомудрия и, вынув из ножен меч, трижды ударяли плашмя по плечу кандидата, напоминая о тех подвигах, которые он должен совершить во имя Господа. Сам вступающий получал меч и трижды вскидывал его вверх, во имя Пресвятой Троицы, вызывая на бой врагов христианской веры. Потом он вкладывал меч в ножны, что подтверждало то, что кандидат чужд всех пороков. Два рыцаря надевали ему на сапоги золотые шпоры. Ему читали проповедь непрестанно стремиться к похвальным делам и попирать золото ногами. После этого со свечами в руках все слушали торжественную мессу. Затем будущего иоаннита спрашивали, не женат ли он, не имеет ли долгов, не давал ли он обета в другом ордене. Кандидат отвечал, брал в руки Священное Писание и трижды торжественно клялся в том, что отвечал. После этого его ставили в рыцарский строй. На шею ему вешалась веревка, означавшая иго Господне, а в руки давался вышитый на чистом полотне восьмиконечный крест, напоминавший новому рыцарю о необходимости проливать свою кровь, защищая от врагов христианскую веру. После поступления в Орден рыцарь-иоаннит мог добавлять в свой герб орденскую символику.
В 1535 году большой флот иоаннитов был восстановлен после ужасного мальтийского урагана 23 октября 1533 года. Трижды в год выходил рыцарский флот в крейсерское плавание в открытое море из Большой Мальтийской гавани, закрываемой железной цепью. В 1535 году флот мальтийских рыцарей совместно с испанскими кораблями совершил рейд на алжирских пиратов Хайруддина Барбароссы. Испанцы и рыцари осадили и взяли турецкую крепость Гуллету, служившую Барбароссе арсеналом, захватили триста пушек, девяносто галер и освободили десять тысяч христианских пленников. Штурмом был взят Тунис, бывший тогда пиратской базой. Многие годы рыцари освобождали тысячи пленных христиан, громили пиратов. Борьба с ними принесла флоту мальтийских рыцарей европейскую славу.
В 1547 и 1551 годах турецкий десант высаживался на Мальте. Турки были сброшены в море, но успели разграбить плохо укрепленные районы островов Мальта и Гоццо. Рыцари выбили десант в море и начали укрепление островов фортификационными сооружениями. У входа в Большую Мальтийскую гавань они выстроили мощный форт Сент-Эльмо, отстроили форт Сан-Анжело, первый форт Святого Ангела, укрепили Биргу. У нового города Сенглеа был построен форт Сан-Микаэль. Современники писали, что Мальтийский орден «ревностно преследовал африканских пиратов, чуть ли не ежедневно привозя в Большую Мальтийскую гавань захваченные корабли с богатой добычей, так что морские силы ордена развились небывалым образом».
В 1551 году турецкие войска на ста двадцати кораблях с двенадцатью тысячами солдат во главе с Синан – пашой попыталась высадиться на Мальте, но были отброшены рыцарями. Турецкий флот пошел на Триполи. Гарнизон мальтийских рыцарей во главе с маршалом ордена Гаспаром да Валлье мужественно оборонял замок Триполи, который туркам все же удалось захватить. Через девять лет восемь галер Мальтийского ордена совместно с испанскими кораблями участвовали в попытке возвращения этого важного стратегического порта в Северной Африке, то Триполи отбить не удалось.
В августе 1557 года Великим Магистром Мальтийского ордена был избран гасконец Жан Паризо де ла Валетт. Он уже участвовал в защите Родоса в 1522 году от армии Сулеймана Великолепного. Ла Валетт часто выходил в море еще и как адмирал мальтийского орденского флота. Новый Великий Магистр, знавший итальянский, испанский, греческий, арабский и турецкий языки, пригласил на Мальту знаменитого военного инженера и фортификатора Бальтазаре Ланчи, который занялся укреплением фортов Мальты. На Мальте был построен и новый большой госпиталь.
18 мая 1565 года тридцатитысячная турецкая армия, состоявшая только из янычар, высадилась на Мальте. Во главе ее стоял знаменитый сераскер Мустафа – паша, штурмовавший в 1522 году Родос. У Великого Магистра было шестьсот рыцарей и семь тысяч солдат. Чуть позже из Сицилии удалось перебросить на Мальту пятьсот рыцарей и тысячу испанских аркебузиров.
Форт Сент-Эльмо защищали сто двадцать рыцарей и рота испанцев. Турецкие штурмы и канонады форта следовали один за другим. В течение месяца яростно отбивался гарнизон, пока не погиб, положив под стенами Сент-Эльмо десять тысяч янычар.