В 1560 г. на берегу речки Тихвинки положено было основание святой обители во славу Тихвинской иконы Богоматери, Заступницы земли Русской и Путеводительницы православных христиан. Над арками святых врат сохранился фрагмент надписи: «Благодатию Христовою и Благоволением Пресвятыя Владычицы нашея Богородицы и Приснодевы Марии и тоя помощию, повелением же Царя и великого князя Иоанна Васильевича всея Русии начало и устроение бысть монастырю сему в лето 7068 февраля в 11 день». Торжественные службы по этому поводу прошли в присутствии царской семьи в московском Успенском и новгородском Софийском соборах. Весной–летом того же года был срублен монастырь, сначала деревянный, но добротный и вместительный «по чину великих обителей». Монастырю суждено было стать домом для величайшей православной святыни, пережить времена и славные, и смутные, служить рубежом обороны от иноземных захватчиков, всегда при этом оставаясь источником чистого духовного сияния, на который стремились паломники со всей православной России.
Предыстория и история монастыря, как, впрочем, и его будущее, неразрывно связаны с чудотворной Тихвинской иконой Божией Матери Одигитрии (что в переводе с греческого означает «путеводительница», «указующая путь»). Как уже упоминалось, тот образ был написан, по преданию, св. апостолом евангелистом Лукой во время земной жизни Девы Марии. Св. Лука послал икону вместе с текстом Евангелия и Деяний Св. Апостолов в дар правителю Антиохии Феофилу. Позднее, уже в V в., икона оказалась в Константинополе, где для нее была выстроена знаменитая Влахернская церковь-реликварий, ставшая хранилищем главных святынь Византии – первой христианской империи. В 1383 г. за 70 лет до падения Константинополя «сия икона Одигитрия взялась из него манием Божием и перенеслась на Русь». Образ Богоматери чудесно, по воздуху скрылся из Царьграда и явился рыбакам над Ладожским озером, рядом с древнейшей столицей Руси, Старой Ладогой. Константинопольский патриарх, выслушав свидетельства новгородских купцов и их описания образа, подтвердил, что явленная на Руси икона и есть та самая, что отбыла из Византии невозвратно «за гордость, братоненавидение и неправды народа». В тихвинскую землю икона переместилась вскоре после победы объединенных русских войск под началом благоверного князя Димитрия Донского над ордами Мамая. Согласно летописи, «в лето 6891 от Сотворения мира, июня в 26 день (9 июля 1383 г. по Р.Х..
По окончании строительства пономарь Юрыш, человек благочестивый, был послан оповестить окрестных жителей о времени освящения храма. Недалеко от нового храма Юрышу явилась Божия Матерь со святителем Николаем Чудотворцем и повелела устами святителя ставить на храм деревянный, а не железный, крест, потому что именно на деревянном кресте был распят Иисус. На месте беседы св. Николая с Юрышем тогда же поставили часовню, а в XVI в. был основан Николо-Беседный мужской монастырь. Располагался этот монастырь в Новгородской епархии, в окрестностях Тихвина. Основан он был в 1510 г. великим князем Василием Ивановичем на месте явления Божией Матери со св. Николаем клирику Георгию (Юрышу). В монастыре находилась изображающая это чудесное событие «беседная» икона древнего письма «Явление Божией Матери клирику Георгию». В часовне монастыря хранился весьма чтимый крест, сделанный из колоды, на которой сидела Божия Матерь при явлении Георгию; здесь же находилась икона Господа Саваофа, написанная на доске из той же колоды. День явления Богоматери Георгию – 14 августа – праздновался в монастыре с особенной торжественностью. Событие это послужило также основанием для написания иконы. Современники, однако, не сразу поверили Юрышу, и когда стали устанавливать на купол кованый железный крест, рабочего, который это делал, невидимой силой, дуновением ветра сняло с купола вместе с крестом и поставило невредимым на землю. Кресты же все на соборе и по нынешнюю пору деревянные.