Быстрая победа над французской армией вызвала рост амбиций итальянских государств. Обострилась борьба между Венецией и Миланским герцогством, Тосканским герцогством и Папским государством. Население Пизы восстало против флорентийского господства. В этой ситуации новый французский король Людовик XII Валуа-Орлеан предпринял новый поход в Италию. Осенью 1499 г. его войска захватили Милан. Ломбардия была объявлена частью королевского домена. В 1500 г. Людовику XII удалось также договориться с Фердинандом Арагонским о разделе Неаполитанского королевства. На следующий год французские и испанские войска вторглись в Южную Италию. Но столкновения между ними из-за спорных территорий вскоре переросли в войну. В 1504 г. французы были вытеснены с юга Апеннинского полуострова. Территория бывшего Неаполитанского королевства вместе с Сицилией, принадлежавшей Испании, вошла в состав нового Королевства обеих Сицилий под испанским протекторатом. Договор Франции и Испании о трехлетнем перемирии, заключенный в 1504 г., закрепил их господство на полуострове.
Внешняя угроза не только не сплотила итальянские государства, но и вызвала новый виток их соперничества. Пользуясь поддержкой Франции, Венеция начала бороться за преобладание в Центральной Италии. Она увеличила свои владения в Ломбардии, утвердилась в Романье после падения там власти Чезаре Борджа, а также приобрела крупные города в Апулии. В 1504 г. папа Юлий II создал анти-венецианскую коалицию, которая в 1508 г. была названа Камбрейской лигой. Пытаясь ослабить враждующие итальянские государства, анти-венецианскую коалицию поддержали Франция, Испания и Империя. В мае 1509 г. в битве при Аньяделло армия Венеции была разгромлена. Венеция была вынуждена отказаться от притязаний на Романью и территории в Северной и Южной Италии.
Вернув контроль над Романьей и ограничив амбиции Венеции, папа Юлий II попытался вытеснить французские и имперские войска с севера Италии. Для этого он организовал в 1511 г. «Святейшую лигу». Эту коалицию североитальянских городов поддержали Венеция и Испания. Первоначально Людовику XII удалось разгромить армию лиги, состоявшую из испанских и швейцарских наемников. Но, когда на сторону его противников перешли император Максимилиан I и Англия, французам пришлось оставить Милан и крепости в Ломбардии.
Перерыв в военных действиях оказался недолгим. Уже в 1513 г. произошло радикальное изменение политической ситуации. Испания, присоединив к своим владениям на юге Апеннин важные торговые порты Апулии и добившись признания Франции на захват ею Наварры, временно отказалась от участия в Итальянских войнах. Новый папа Лев X из рода Медичи настоял на восстановлении во Флоренции власти Медичи. Опасаясь дальнейшего усиления Папского государства, Венеция заключила договор с Францией. Новый французский король Франциск I возобновил в 1515 г. военные действия в Северной Италии. В сентябре франко-венецианские войска в битве при Мариньяно разгромили швейцарцев. После этого Швейцарская конфедерация в Итальянские войны уже не вмешивалась. В 1521 г. между Францией и всеми швейцарскими кантонами, кроме Цюриха, был подписан договор о союзе, позднее не раз возобновлявшийся и действовавший до конца XVIII в. Камбрейский мирный договор 1517 г. между Францией, Испанией и Империей привел к временному умиротворению на основе взаимной гарантии фактических границ. Франция вновь утвердилась в Милане, а Венеция восстановила свои владения в Северной Италии, утраченные в войне с Камбрейской лигой.