Вскоре непрочный мир на Апеннинском полуострове вновь был нарушен. Причиной стало резкое изменение международной ситуации. В 1519 г. испанский король Карл I под именем Карла V стал императором Священной Римской империи. Но попытки испанского монарха создать общеевропейскую «универсальную империю» встретили ожесточенное сопротивление со стороны французского короля Франциска I. В их противоборстве Италия превратилась в важнейший в стратегическом отношении регион. Весной 1521 г. армия Франциска I вторглась в Северную Италию. Военные действия шли с переменным успехом. Развязка наступила в 1525 г., когда французская армия была разгромлена в битве при Павии, а сам король Франциск I попал в плен (освобожден он был после того, как согласился на отказ от Милана и возвращение Габсбургам Бургундии). Понимая угрозу со стороны усилившейся Испании, итальянские государства попытались создать новую коалицию. Инициатором выступила Венеция, вступившая в переговоры и с Франциском I. В 1526 г. во французском городе Коньяке был заключен союз между Венецией, Папским государством, Генуей, Флоренцией, Миланом и Францией. Протектором Коньякской лиги объявил себя король Англии. Однако создать боеспособную армию итальянцам не удалось. Весной 1527 г. войска Карла V захватили Милан и Рим, подвергнув их страшному опустошению. Не изменился ход войны и после активизации Франции. Первоначально французам удалось отвоевать часть Неаполитанского королевства, осада Неаполя союзным флотом Франции и Венеции окончились неудачей. К тому же во французской армии началась эпидемия чумы. Франция была вынуждена заключить в августе 1529 г. мир в Камбрэ, по которому Карл V получил титул короля Италии и владение Неаполитанским королевством.
Новое военное столкновение Франции и Испании произошло в 1526–1529 гг. и завершилось новой победой Карла V. По условиям Кабрейского мира Франциск I окончательно отказался от притязаний на Италию и сюзеренитета над Фландрией и Артуа. На Болонском соборе 1530 г. папа Климент VII короновал Карла V немецкой и итальянской коронами. Однако мечта Карла о европейской «универсальной империи» оказалась несбыточной. Германские государства втягивались в религиозную конфронтацию. Юго-Восточная Европа оказалась под угрозой турецкого нашествия. В 1536 г. началась и новая франко-габсбургская война. Она длилась всего три года и завершилась присоединением к Франции Савойи и Пьемонта. Правда Франциску I пришлось примириться с окончательным присоединением Милана к империи Габсбургов. Пытаясь развить успех, французский король решился на заключение союза с турками. Объединенный франко-турецкий флот сумел захватить в 1543 г. Ниццу. Однако Карл V во главе сухопутной имперской армии вторгся во Францию. Лишь сложная политическая ситуация в Германии заставила его приостановить военные действия и заключить мир на условиях статус кво.
Во время последней из франко-габсбургских войн (1551–1559) Апеннинский полуостров вновь стал ареной военных действий. Новый французский король Генрих II вмешался в конфликт между Пармой и Папским государством. Он заставил папу отказаться от союза с Карлом V и с помощью турецкого флота захватил остров Корсику. Одновременно французы успешно развивали наступление в Лотарингии. Но закрепиться в Тоскане им не удалось. Попытка поддержать республиканское восстание в Сиене привела к конфликту Франции с Флоренцией. Положение Карла V также становилось все более сложным. В 1556 г. ему пришлось отречься от имперского престола в пользу своего младшего брата, австрийского эрцгерцога Фердинанда I. Пользуясь этой ситуацией, новый папа Павел IV попытался организовать анти-испанскую коалицию. В ответ испанцы вторглись в Папскую область в сентябре 1556 г. и жестко подавили все попытки сопротивления. Генрих II ничем не смог помочь своему союзнику, поскольку его армия была втянута в затяжные военные действия на северной границе Франции.
В 1559 г. Франция и Испания, истощенные длительными войнами, заключили мир. В соответствии с договором, подписанным в Като-Камбрези, Франция лишилась всех своих итальянских завоеваний, за исключением нескольких городов в Пьемонте. Испания утвердила свою гегемонию на Апеннинах и во всем Западном Средиземноморье. Королевство Обеих Сицилий, Миланское герцогство, область Президии (мелкие владения в Тоскане) вошли в состав испанской монархии. Независимость сохранили Папская область, Савойское герцогство (включавшее Савойю, Пьемонт и Ниццу), Генуэзская республика с островом Корсика, Венецианская республика с подвластными ей территориями на восточном побережье Адриатического моря и в Ломбардии, герцогство Тосканское, а также более мелкие герцогства Парма и Пьяченца, Модена, Мантуя, Феррара, Урбино, маркграфство Монферрат, республики Лукка и Сан Марино. Но практически все они в той или иной степени оказались зависимы от Испании.
Италия во второй половине XVI–XVII вв.