Поддержка польской знати и изменническая позиция московских бояр все-таки возвели на русский трон Лжедмитрия I – Григория Отрепьева, который попытался через своих единомышленников привлечь патриарха Иова на свою сторону, но патриарх решительно отказался от контактов с мнимым царевичем и не присягнул ему. Патриарх Иов знал, что, не поддерживая мнимого царевича, он подвергает свою жизнь большой опасности. Даже вдова царя Ивана Грозного – Марфа Нагая под влиянием угроз быть убитой «признала» в объявившемся царевиче своего сына Дмитрия, якобы убитого в Угличе в 1591 г., но на самом деле спасшегося, что якобы 14 лет держалось в тайне. Многие бояре, в том числе знатный боярин Василий Иванович Шуйский (ставший впоследствии царем), «признали» царевича Дмитрия во имя сохранения жизней и приобретения его расположения. Только патриарх Иов непоколебимо утверждал, что явился самозванец. Лжедмитрий решил убрать его с патриаршего московского престола, причем убрать руками московских изменников – бояр. Когда патриарх Иов совершал божественную литургию в Успенском соборе московского Кремля в 1605 г., вооруженная толпа во главе с боярином П.Ф. Басмановым ворвалась в алтарь этого собора. С патриарха сорвали святительские священные одежды, таскали старца по храму, смеялись над ним и оскорбляли его, затем потащили к Лобному месту. Его заставили одеть черную одежду простого монаха и на телеге отправили в заточение в Успенский Старицкий монастырь. На якобы пустующий патриарший престол Лжедмитрий решил возвести послушного ему рязанского архиепископа Игнатия. Тот отправился в Старицу за благословением на патриаршее восшествие от святителя Иова. Но, несмотря на угрозы, святитель Иов не дал ему благословение.
Патриарх Иов. Рисунок XIX в.
В 1606 г. на русский царский трон сел боярин Василий Иванович Шуйский. Новый русский царь и представители духовенства просили патриарха Иова возвратиться на патриарший престол, но он отказался из-за своего возраста и болезней и благословил на патриаршее восшествие митрополита Казанского Гермогена. Позже по просьбе патриарха Гермогена святитель Иов в 1607 г. приехал в Москву для принятия всенародного покаяния о предательстве законных царей Бориса Федоровича и Федора Борисовича Годуновых, о поддержке лжецаря Димитрия. В Успенском соборе Московского Кремля архидиакон прочитал народу разрешительную грамоту святителя Иова, который прощал народ и сам просил у него прощения, призывал всех хранить верность православию и законным царям.