Правление Синьории было восстановлено в форме, существовавшей в XV в., но социально-политическая борьба продолжалась. В 1527 г, Медичи были вторично изгнаны. Три года и три месяца существовала республика. Это были годы острой социальной борьбы. В последний год власть находилась в руках ремесленников и мелких торговцев, в руках «людей незначительных и малоимущих», по словам деятельного участника описываемых событий Франческо Гвиччардини. Впоследствии патриции говорили о республике как о периоде, когда плебеи угнетали знать, а бедные старались лишить богатых имущества.
Десять месяцев военные силы императора Карла V, поддержанные папой Климентом VII, Медичи и частью патрициев, осаждали Флоренцию. Город героически сопротивлялся. Идеи борьбы за свободу и равенство воодушевляли большинство населения. Но голод и экономическая разруха, переход на сторону врага патрицианской молодежи и измена военачальников заставили пойти на капитуляцию и пополанов. Опыт последней республики еще раз показал, что ни патриции, ни пополаны своими силами во Флоренции править уже не могли.
В город вернулись Медичи. Правителем стал племянник папы Климента VII Алессандро. Император и папа понимали, что власть Медичи не будет прочной, пока существует республиканский режим. Но они предпочли, чтобы инициатива конституционных перемен исходила от патрициата, который стал сознавать, что не сможет находиться во Флоренции, если там нет дома Медичи.
Новая конституция 1532 г. предусматривала создание в качестве высших органов власти Совета двухсот и Совета сорока восьми с пожизненным членством. Государство возглавил Алессандро Медичи под компромиссным титулом «герцога Флорентийской республики», его деятельность контролировали 4 советника из наиболее влиятельных цатрициев. Ни одна социальная прослойка республики не была довольна. Пополаны не перестали мечтать о республике; часть патрициев, считая, что герцог ограничивает их свободу, покинула город.
Критический момент наступил в 1537 г., когда Лоренцино Медичи убил своего родственника герцога Алессандро. Патриции Флоренции избрали новым государем представителя боковой линии Медичи — 17-летнего Козимо, считая его неопытным, наивным молодым человеком. Козимо при избрании обещал не принимать никаких решений без согласия патрицианских советников, но он оказался сильной, волевой личностью и с первых дней правления стал действовать самостоятельно, вскоре полностью отстранив от государственных дел поддержавших его патрициев; оказавшие вооруженное сопротивление были разбиты, затем подвергнуты казням и арестам.
Так закончилась длившаяся более 40 лет борьба за власть во Флоренции. Изменение государственного строя было закономерным явлением. Республика не соответствовала ни новой социальной стратификации общества, ни необходимости дальнейшего сплочения регионального государства. Флорентийское государство со значительным опозданием дошло до конституционно оформленного монархического устройства, которое в Миланском, Мантуанском, Феррарском и других государствах существовало давно.
Тосканское великое герцогство в первые годы его существования оказалось под угрозой поглощения владениями Карла V. Но уже тогда Козимо I (1537–1574) проявил незаурядные политические способности. Как истинный потомок купеческо-банкирской семьи Медичи, он, по словам венецианского посла, «всей душой был предан деньгам, только на деньги надеялся и деньгам доверял». В короткий срок были накоплены нужные средства, чтобы выкупить занятые войсками императора крепости Пизы и Ливорно (1543 г.). Это обеспечило Тоскане свободу рук в политическом отношении. И впоследствии Козимо и его потомки пользовались своими огромными финансовыми ресурсами, чтобы добиться политических успехов. Другим излюбленным средством была игра на политических противоречиях между Испанией и Францией, Империей и папством, облегчившая и прямой захват: так, в 1557 г. была присоединена Сиенская республика. Козимо I добился от папы титула Великого герцога (1569 г.); наиболее успешно эту политику продолжил его сын Фердинанд (1587–1609).
Первые великие герцоги стремились сосредоточить всю власть в своих руках. Опорой их абсолютистской политики стал бюрократический аппарат. Отдельные отрасли управления находились в ведении секретарей, аудиторов, имеющих многочисленный штат чиновников. Укреплению власти правителей способствовало также созданное ими постоянное войско.
Путем издания законов, обязательных для всего государства, и подчинения местных органов управления более тщательному контролю герцоги пытались осуществить политику централизации. Несмотря на несомненные успехи, полной интеграции достичь не удалось, некоторые города и земли сохранили местные органы управления. По мере предоставления новых феодов, главным образом в XVII в., появлялись и новые иммунитетные территории наряду с сохранением ряда старых феодальных владений. В целом нововведения наслаивались на старую основу.