Рэли более не снаряжал экспедиции в Вирджинию. Патент, полученный от королевы, он передал в 1589 г. группе коммерсантов, которые, однако, не воспользовались им. В 1602 г. патент попал в руки более энергичных людей, которые с 1606 г. Начали колонизацию Вирджинии. Новые поселенцы узнали, что большинство людей, оставленных Уайтом, было убито, некоторым, правда, удалось спастись; они бежали на материк, где жили в мире и согласии с индейцами. Сообщали, что в живых осталось семь англичан — четверо мужчин, двое мальчиков и одна девочка, — но их никто никогда не видел.
Вторая половина 80-х годов XVI в. знаменовала собой быстрое нарастание враждебности в отношениях между Англией и Испанией. Дело явно шло к войне.
Филипп II, потеряв надежду убрать с английского престола Елизавету после провала заговоров против нее и казни Марии Стюарт в конце 1587 г., готовился к прямому нападению на Англию, создавая невиданный по размерам флот. Во всех портах Испании и Италии кипела работа: строились корабли, свозилось вооружение и продовольствие, сосредоточивались войска. В Англии упорно говорили о прибытии гигантской испанской эскадры уже летом 1587 г.
Елизавета, все время старавшаяся избежать военного конфликта с Испанией, под давлением «военной партии», которую возглавлял государственный секретарь Уолсингем, дала согласив на экспедицию Дрейка к берегам Испании. Дрейк, разгромив испанский флот в Кадисе в апреле 1587 г., сорвал нападение на Британские острова. Но всем — и в Испании, и в Англии — было ясно, что это лишь временная отсрочка.
Как ни увлечен был Рэли осуществлением планов английской колонизации Америки, он, понимая, что в англо-испанских отношениях наметился острейший кризис, со всем пылом включился в подготовку к войне с Испанией. В 1587 г. Рэли передал королеве построенный лишь за год до этого превосходный по своим мореходным и боевым качествам корабль «Ковчег Рэли», переименовав его в «Королевский ковчег». Этот корабль стал флагманским судном королевского военно-морского флота.
В ноябре 1587 г. Рэли был назначен членом военного совета, ответственного за подготовку к отражению возможного нападения испанского флота на Англию. Рэли отвечал за оборону побережья в районе Девоншира и полуострова Корнуолл, но его неукротимая энергия не знала границ. Он укреплял прибрежные города, расставлял наблюдательные посты, готовые дать сигнал о приближении врага, создавал местные вооруженные отряды. Так, он добился, чтобы жители Корнуолла выставили 5 тысяч солдат, дали 1,5 тысячи ядер, 700 лат, 2 тысячи алебард, 1,5 тысячи луков, 100 лошадей. Но ни сам Рэли, ни его солдаты в боях с испанцами практически не участвовали.
Испанский флот — «Непобедимая армада» — прошел мимо юго-западных берегов Англии, не высадив десанта. 23—27 июля произошло морское сражение в районе Портленда, а 28-го — у Кале. Испанский флот понес поражение. Непрерывно преследуемый английскими кораблями, он прошел вдоль французских берегов, повернул на север к Шотландии, миновав которую взял курс к родным берегам.
Возвращение в Испанию было поистине ужасным. Люди были истощены до предела. Запасы продовольствия и воды кончались. Штормы и туманы разбросали корабли. Десятки судов разбились о скалы у шотландских и голландских берегов. В сентябре 1588 г., когда корабли бывшей «Непобедимой армады» начали прибывать в испанские порты, стали известны размеры потерь. Из 134 судов эскадры вернулось не более 50. Из 26 тысяч солдат и матросов погибло не менее 20 тысяч. Потери английского флота были незначительны. Не был потоплен ни один корабль, число убитых не превышало 100 человек.
Разгром «Непобедимой армады» вызвал большое оживление приватирства в Англии. Рэли, который уже несколько лет посылал свои суда в пиратские экспедиции, не замедлил присоединиться к намечавшемуся весьма крупному делу: готовилось нападение непосредственно на испанскую территорию. В середине сентября 1588 г. Фрэнсис Дрейк и Джон Норрис, прославленный солдат, ветеран войнц против герцога Пармы в Нидерландах, передали королеве план операции по захвату Лиссабона. Рэли не только выделил для экспедиции один из своих кораблей, но и сам принял в ней участие.
Португальская экспедиция 1589 г. окончилась неудачей. Основная ее цель — захват Лиссабона — не была достигнута. Из 16 тысяч человек, отправившихся в экспедицию, в живых осталось 6 тысяч. Шесть судов было потеряно; правда, ни один королевский корабль не пострадал. Фактические расходы королевы составили 50 тысяч фунтов стерлингов вместо 20 тысяч. Для скупой Елизаветы это было большой неприятностью.
Хотя неудовольствие королевы по поводу провала экспедиции не сказалось прямо на Рэли, тем не менее при дворе почувствовали, что небо над ним стало не таким уж безоблачным. Уже тот факт, что Елизавета отпустила его в плавание, чему раньше решительно препятствовала, свидетельствовал о том, что королевская милость как будто бы начала ослабевать. В августе 1589 г. Рэли уехал в Ирландию, что тоже было показательно. Раньше он ни на один день не покидал королевского двора.