Простое начало. Как четыре закона физики формируют живой мир

Получается, читать ДНК нелегко. Через 15 лет после открытия пространственной структуры ДНК Рэй Ву и Дейл Кайзер сумели распознать 12 нуклеотидов в геноме вируса[49]. Весь этот геном содержит около 48 тысяч нуклеотидов. Пять лет спустя Аллан Максам и Уолтер Гилберт получили последовательность из 24 нуклеотидов ДНК – область lac-оператора (см. главу 4). Для этого потребовалось два года напряженной работы – на секвенирование с такой скоростью генома человека ушло бы 250 миллионов лет. Явно были нужны куда более эффективные методы.

И такие методы появились¹. Несколько следующих страниц мы посвятим именно им – и не только из-за их значимости в современном мире, но и потому, что одним своим существованием они заявляют о важности познания физической природы ДНК и других биомолекул. Понятийным фоном для этой практической главы послужат такие свойства, как размер, жесткость и электрический заряд, и такие темы, как самосборка и предсказуемая случайность.

В 1976–1977 годах появились два остроумных метода определения последовательности ДНК: один разработали те самые Максам и Гилберт, а другой – Фредерик Сэнгер с коллегами. Метод Сэнгера оказался проще и в итоге доминировал в отрасли больше двух десятилетий. Я начну рассказ о техниках чтения ДНК именно с секвенирования по Сэнгеру.

Представьте, что у вас нет возможности последовательно, буква за буквой читать слово М-О-Л-Е-К-У-Л-А, но вы видите перед собой множество оборванных копий этого слова, в каждой из которых различима лишь последняя буква: «??Л», «?О», «?????У» и так далее. Заметив, что все трехбуквенные фрагменты оканчиваются на Л, все четырехбуквенные – на Е и так далее, вы установите, что вместе они образуют слово МОЛЕКУЛА. В принципе, в этом и состоит суть метода Сэнгера и еще нескольких подходов: чтение осуществляется путем распознавания отдельных кусочков, а не последовательного движения по цепи.

В главе 1 мы уже описывали несколько шагов из этого рецепта. Представьте себе не весь геном, а что-то более податливое – скажем, фрагмент ДНК размером несколько сотен пар нуклеотидов. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) создает несметное число копий этого фрагмента, а тепло разделяет каждую двойную спираль на одноцепочечные половинки. Пока забудьте об одной из них и представьте миллионы идентичных одноцепочечных ДНК. Как вы помните, ДНК-полимераза создает идеальный комплемент любой цепи ДНК: руководствуясь принципом комплементарности, она сшивает из свободных нуклеотидов новую партнерскую цепь. А теперь представьте, что ученый применяет ДНК-полимеразу для репликации ДНК, как в нормальной ПЦР, но вводит в массив свободных нуклеотидов небольшое количество дефектных молекул: они мало отличаются от обычных A, Ц, Г, T и по-прежнему встраиваются в растущую цепь ДНК, но уже к ним новые нуклеотиды присоединиться не могут. Полимераза не умеет отбраковывать такое строительное сырье, и если ей попадается нормальный свободный нуклеотид, новая цепь удлиняется, если же встраивается измененный вариант, он блокирует дальнейший синтез и остается в цепи последним. Поскольку добавление терминирующих нуклеотидов происходит по воле случая и сравнительно редко, ученый получает множество цепочек ДНК, которые начинаются одинаково, но различаются по длине.

Пока складывается впечатление, что измененные нуклеотиды просто нарушают ход ПЦР, однако они сконструированы так, чтобы не только препятствовать удлинению ДНК, но и работать «маячками» – испускать свет одного из четырех цветов, уникальных для не-совсем-A, не-совсем-Ц, не-совсем-Г и не-совсем-T. Распознаваемым сигналом могут служить не только цвета. Сначала в секвенировании по Сэнгеру использовали радиоактивные метки, а вместо ПЦР (которую тогда еще не изобрели) для клонирования ДНК привлекали бактерий. Здесь мы описываем более поздние и эффективные разновидности метода, основанные, однако, на тех же принципах[50].

На последнем этапе плавления ДНК-дуплекс разделяется на две нити, и фрагменты разной длины оказываются маркированными на концах: теперь они напоминают те куски слов, где видно лишь последнюю букву. Ученый по-прежнему не знает длину конкретных фрагментов, и они слишком малы, чтобы наблюдать их в видимом свете. Как мы узнали из главы 1, ПЦР эксплуатирует одну из важных физических характеристик ДНК – плавление, то есть разделение двойной спирали на отдельные цепи при превышении специфической температуры. Секвенирование по Сэнгеру задействует и другое важное свойство ДНК – электрический заряд.