И несмотря на это — или как раз поэтому — в 1864 году они стали союзниками в войне против Дании, в которой борьба шла вокруг Шлезвиг-Гольштейна. Присоединение в то время принадлежавшего Дании Шлезвиг-Гольштейна был главным требованием немецкого национализма, как раз в качестве конкурентов в борьбе за Германию Австрия и Пруссия не могли обе не взяться за это дело, когда оно вдруг снова стало насущным. Уже в 1848 году дело доходило до вооруженных выступлений из-за Шлезвиг-Гольштейна. Конгресс государств в Лондоне тогда в конце концов решил, что Шлезвиг-Гольштейн должен оставаться в союзе с Данией, но только в персональной унии. Теперь же датский король умер, не оставив детей, различные наследники в Дании и в Шлезвиг-Гольштейне сделали персональную унию невозможной и Дания, не обращая более внимания на лондонский протокол, аннексировала Шлезвиг. Как государства, подписавшие лондонский протокол, Австрия и Пруссия в ответ на это выставили Дании ультиматум — отменить аннексию. 1-го февраля 1864 года началась война.
При атаке на Дюппелерские укрепления война дала прусской армии первую возможность продемонстрировать свое качество, восстановленное путем военной реформы короля Вильгельма. Но это было самое незначительное. В военном смысле в войне двух великих держав против маленькой Дании нельзя было добыть много славы. Трюк состоял в том, чтобы устранить вмешательство других великих держав, которыми были все подписавшие лондонский протокол, из которых в особенности Англия приняла сторону Дании. Удалось избежать интервенции, частично благодаря искусному сдерживанию Бисмарка. Он требовал (к вящему негодованию немецкого общественного мнения) — ни в коем случае не связывать тесно Шлезвиг-Гольштейн с Германией, а лишь строгого восстановления status quo — частично из-за упрямства, с которым Дания настаивала на противоречащей протоколу аннексии Шлезвига. Во всяком случае результат был таков, что Дания была вынуждена при молчаливом согласии всех государств уступить Шлезвиг-Гольштейн Австрии и Пруссии для совместного дальнейшего владения. Тем самым для Австрии не было достигнуто ничего полезного — что она должна была делать с изрядно от нее отдаленной землей Шлезвиг-Гольштейна? Для Пруссии же это не только была претензия на приобретение территории, но и прежде всего то, что более всего требовалось Бисмарку: яблоко раздора, из-за которого она в любой момент могла начать войну с Австрией.
Нельзя сказать, что он хотел этой войны при любых обстоятельствах. "К моей цели ведут множество путей", — выразился он позже. "Я должен выбирать их по порядку, причем самый опасный в последнюю очередь". Чего он хотел — так это роспуска Германского союза, который он расценивал как обременительные оковы для прусской политики, и неограниченного господства Пруссии в северной части Германии. Он был готов передать южную Германию под соответствующее австрийское господство. Если он мог достигнуть этой цели путем мирных переговоров с Австрией, то тем и лучше.
Разумеется, даже такого мирного соглашения о разделе Германии по реке Майн нельзя было получить без давления, и в течение двух лет между Датской войной и Немецкой войной Бисмарк неустанно работал над международной изоляцией Австрии. В России, с которой Австрия и без того находилась в постоянной конкуренции на Балканах, ему с этой целью было легко вести игру. С Францией дело было сложнее, поскольку у французского императора Наполеона III были свои планы. Он надеялся из войны между Австрией и Пруссией извлечь пользу для себя и в качестве цены за роль третейского судьи получить "компенсации" на левом берегу Рейна, возможно даже отодвинуть границу до Рейна. Дать согласие на это Бисмарк не мог и не желал, если он не хотел испортить отношения со своим вторым союзником, немецким национализмом; но он был вполне готов давать императору Наполеону смутные и сковывающие того надежды. Впрочем, Наполеон ожидал, что в австрийско-прусской войне проигравшей, которую он был готов спасти за высокую цену, будет Пруссия — ввиду соотношения размеров обеих противоборствующих сторон вовсе не безрассудное ожидание. Бисмарку также было ясно то, что война с Австрией может быть легко проиграна, по бумагам она даже так и должна была быть проиграна. Австрия все еще была большей и более сильной. Это заставляло его медлить, как и его общее нерасположение к войне, которое в основном основывалось на том, что в войне политика всегда находится в опасности быть отодвинута на второй план военными соображениями. Хотя Бисмарк никогда не боялся войны как крайнего средства политики, но всегда старался по возможности её избежать. Это относится к войне 1866 года и в ещё большей степени к войне 1870 года.