Ситуация, складывавшаяся в районах поселения вольных казаков, привлекала пристальное внимание в Москве. Правительство прекрасно понимало сложность положения на Дону и других казачьих реках, где находились как сторонники, так и противники сближения с Русским государством, опасавшиеся распространения московских порядков на свои юрты. Серьезно осложняли отношения их «воровские» (разбойные) действия казаков в пределах Московского государства, особенно в Поволжье, а также их нападения на Большую Ногайскую орду, находившуюся в союзе с Россией. Поэтому у царских властей сохранялось настороженное отношение к казачьей вольнице, приводившее порой к враждебным акциям против нее.
В 1574 г. Иван Грозный в ответ на жалобы ногайского князя на умножившиеся разбойные нападения на его владения вольных людей предложил ему своими силами уничтожить донских казаков, которые «не по нашему велению на Дону живут». Тогда же воеводам пограничных городов предписывалось казнить всех объявившихся в их крепостях казаков. В правление царя Федора Ивановича отношение к донцам несколько изменилось. 31 августа 1584 г. от его имени на Дон была отправлена грамота, адресованная «донским атаманам и казаком старым и новым», со следующим предложением: «как воинские люди крымские <…> и нагаи пойдут войною на наши украины, или какие воинские люди пойдут с полоном с наших украин, и вы б в те поры на тех людей на перевозех приходили и над ними промышляли <…> а нам тем служили. А мы вас за вашу службу жаловати хотим, а ныне есмя к вам свое жалованье, которым ходили атаманы и казаки под Калмиус, послали с Борисом с Благим, селитру и свинец, а вперед вас своим жалованьем хотим жаловати». В 1592 г. русскому правительству удалось договориться с Низовым войском Запорожским о совместной борьбе с крымскими татарами, пообещав выплачивать им денежное и хлебное содержание. Периодически царское жалованье получали также запорожцы, волжские, терские и яицкие казаки.
Отношения русского правительства с вольными казаками вскоре вновь испортились. В конце XVI в. правительство предприняло попытку взять юрты донских казаков под свой постоянный контроль. На требование Москвы государевым «делом промышлять» под началом головы Петра Хрущова донцы ответили категорическим отказом, заявив, что «прежде сево мы служили государю, а голов у нас не бывало, служивали своими головами. И ныне де рады государю служить своими головами, а не с Петром». По сообщению летописца, «казакам от царя Бориса было гонение велие: не пущали их ни на какой город, куды они не придут, и их везде имаше и по темницам сажаху».
В конце XVI в., из-за бегства населения из центральных районов страны на окраины, ряды казачества стали быстро пополняться. Если в первой половине 1590-х г. обшая численность донского казачества едва превышала 2 тыс. человек, то на рубеже XVI и XVII столетий, как предполагает Н. А. Мининков, численность так называемого Главного войска, размещавшегося в городках Нижнего Дона составляла уже не менее 5–6 тыс. человек. При этом следует учитывать, что значительная часть донского казачества, проживавшего в поселениях выше Раздор и по притокам Дона, не входила в это объединение. С мнением Миненкова можно согласиться. Известно, что в годы Смутного времени казачьи отряды, действовавшие на территории Московского государства, насчитывали не одну тысячу человек «вольных казаков». К ним примкнуло («показачилось») немало крестьян, посадских и служилых людей. Отряды донских, терекских и яицких казаков служили самозванцам и даже интервентам, участвовали во многих мятежах начала XVII в. Тем не менее, правительство знало о имевшемся несогласии в казачьей среде и склонно было поддержать казаков, которые оставались в своих городках, продолжая оберегать русские «украйны». Дважды, в 1606 и 1608 гг. на Дон направлялось царское жалованье. Выплата его прекратилась только в 1609 г., после окружения Москвы войсками Лжедмитрия II и начала польско-литовской интервенции и возобновилась сразу же после избрания на царство Михаила Федоровича Романова.