Схимонах старец Досифей, которого посетил Прохор, благословил его идти в Саровскую обитель: «Гряди, чадо Божие, и пребуди тамо, место сие будет тебе во спасение, с помощью Божией скончаешь там земное свое странствование, только старайся стяжать непрестанную память о Боге в постоянном призывании имени Божия, и вселится в тебя Дух Святый и управит жизнь твою во святыни. Там и настоятель о. Пахомий (из курских) богоугодной жизни, он последователь жития преподобных отец наших Антония и Феодосия». Вернувшись ненадолго в родительский дом, Прохор навсегда простился с матерью и родными. 20 ноября 1778 года прибыл в Саров. День Введения во храм Пресвятой Богородицы был днем введения Прохора Мошнина в Саровскую обитель. Настоятелем тогда был мудрый старец отец Пахомий. Он ласково принял юношу и назначил ему в духовники старца Иосифа, казначея. О. Пахомий и о. Иосиф любили его «как свои души». Под их руководством Прохор проходил многие послушания в монастыре: был келейником старца, трудился в хлебне, просфорне и столярне, нес обязанности будильщика и пономаря и все исполнял с ревностью и усердием, служа как бы Самому Господу. Постоянной работой он ограждал себя от скуки — этого, как позже он говорил, «опаснейшего искушения для новоначальных иноков, которое врачуется молитвой, воздержанием от празднословия, посильным рукоделием, чтением слова Божия и терпением, потому что рождается оно от малодушия, беспечности и празднословия». В храме стоял он с опущенными глазами для избежания развлечения, напряженно и внимательно слушал пение и чтение, сопровождая их умной молитвой. Уединялся в келлии и выполнял правило прп. Пахомия Великого. Читал, во-первых, книги Священного Писания — Евангелие, Апостольские послания и Псалтирь; во-вторых, отцов: свт. Василия Великого, прп. Макария Великого, прп. Иоанна Лествичника, Четьи-Минеи свт. Димитрия Ростовского.
Уже в эти годы Прохор по примеру других монахов, удалявшихся в лес для молитвы, испросил благословение старца в свободное время тоже уходить в лес, где в полном одиночестве творил Иисусову молитву. Преподобный устроил шалаш и стал предаваться богомыслию и молитве и усилил пост — в среду и пяток совсем не ел, а в другие дни принимал пищу только один раз. Стал переходить от жизни деятельной — пост, воздержание, бдение, коленопреклонение, молитва и прочие телесные подвиги — к жизни созерцательной, которая «состоит в возвышении ума к Господу Богу, в сердечном внимании, умной молитве и созерцании вещей духовных». Братия видели в Прохоре будущую славу Сарова, ибо он, будучи послушником, был выше многих иноков. «В искусе Господь послал Прохору тяжелое испытание — продолжительную и сильную болезнь, как опыт страдания, как пробный камень его веры, упования и терпения».
В 1780 г. Прохор заболел водянкой. Болел три года. Первую половину этого времени Прохор еще перемогался, на ногах держался, но затем слег, ибо тело его распухло. С удивительным терпением переносил он свои страдания, ни одного слова ропота не сорвалось с языка его, он лишь молился и орошал ложе свое слезами. Старцы, опасаясь за жизнь больного, хотели вызвать к нему врача, однако Прохор просил этого не делать, сказав отцу Пахомию: «Я предал себя, старче святый, истинному Врачу душ и телес — Господу нашему Иисусу Христу и Пречистой Его Матери». Отслужили бдение и литургию о здравии больного и причастили его. Тогда же святому Прохору было видение: в несказанном свете явилась Матерь Божия в сопровождении святых апостолов Петра и Иоанна Богослова. Указав рукою на больного, Пресвятая Дева сказала Иоанну: «Сей — от рода нашего». «Пресвятая Богородица, — говорил впоследствии сам преподобный, — правую ручку положила мне на голову, а в левой-то ручке держала жезл и этим-то жезлом и коснулась убогого Серафима; у меня на том месте, на правом бедре-то, и сделалось углубление: вода-то вся в него и вытекла, и спасла Царица Небесная убогого Серафима». И он быстро поправился. Вскоре на месте явления Божией Матери была построена больничная церковь, один из приделов которой был освящен во имя прпп. Зосимы и Савватия, Соловецких чудотворцев. Престол для придела св. Прохор соорудил из кипарисового дерева и всегда приобщался Святых Таин в этой церкви.