Богатство обители и известный аристократизм его иноков не снижали аскетической строгости царивших в нем порядков. Иосифо-Волоколамский монастырь прославился в первую очередь своей строжайшей дисциплиной, неукоснительным соблюдением монастырского устава, составленного самим Иосифом. Сам игумен подавал пример братии. Он, настоятель богатейшей в России обители, до конца своих дней ходил в худых и заплатанных ризах, не гнушался самой черной работой. Знаменитый русский историк В. О. Ключевский приводит такую зарисовку, характерную для повседневной жизни преподобного. «При устроении монастыря, когда у него не было еще мельницы, хлеб мололи ручными жерновами. Этим делом после заутрени усердно занимался сам Иосиф. Один пришлый монах, раз застав игумена за такой неприличной его сану работой, воскликнул: „Что ты делаешь, отче! пусти меня“, и стал на его место. На другой день он опять нашел Иосифа за жерновами и опять заместил его. Так повторялось много дней. Наконец монах покинул обитель со словами: „Не перемолоть мне этого игумена“».
Ученики преподобного — во всяком случае, наиболее близкие к нему — стремились во всем походить на своего учителя. Крутицкий епископ Савва Черный, автор одной из редакций Жития святого, так рассказывает о подвигах братии: «И видели, как эти чудные Христовы страдальцы своей волей сами себя мучили: ночью на молитве стояли, а днем на дело спешили, друг с другом состязаясь. Работа же их шла по наставлению и учению Иосифову — с молчанием и с молитвой, и не было среди них никакого празднословия. Какому же и быть среди них празднословию, когда друг другу в лицо никогда не глядели?.. Все были в обуви из лыка (то есть лаптях. —
Но не сама по себе суровость аскезы, не изнурения плоти, но строгость в соблюдении установленных правил, дисциплина, повиновение игумену составляют основу монастырского устава Иосифа Волоцкого и главную особенность основанного им монастыря. По словам Г. П. Федотова, лишь совершенный запрет горячительного пития и доступа в ограду монастыря женщин и «голоусых» отроков отличали волоколамский быт от быта обычных русских монастырей того времени. (Иосиф отказывает в свидании даже собственной матери, когда та приходит в его обитель.) Не желая отталкивать от монастыря богатых постриженников из князей и бояр, лишь немногие из которых способны были разделить его собственные труды и подвиги, Иосиф допускает для них существенные послабления в уставе (но только по благословению игумена). Он разделяет монахов на три «узаконения» — три категории: первые, из «черных людей», на трапезе, кроме больших праздников, получают только хлеб и довольствуются самой ветхой одеждой. Вторые имеют горячее варево, носят лучшую одежду, кожаную обувь, зимой получают шубу. Третьи, из самых высших слоев общества, получают и рыбное кушанье, и калачи и по две одежды. Но все три категории под одеждой обязуются носить власяницы. В трапезной запрещены всякие разговоры. Во время службы каждый занимает строго определенное для него место, дежурные старцы следят за правильным стоянием на службе и будят задремавших. Запрещены и разговоры в кельях.
Иосиф предписывает и правила внешнего поведения иноков: «Прежде о телесном благообразии и благочинии попечемся, потом же и о внутреннем». Внешнее благочиние — условие для обретения спасения. Он наставляет и мирян, как им надлежит вести себя. В своей главной книге — «Просветителе», Иосиф дает такие правила повседневного поведения: «Ступание имей кротко, глас (голос) умерен, слово благочинно, пищу и питие немятежно, потребне (умеренно) зри, потребне глаголи, будь в ответах сладок, не излишествуй беседою, да будет беседование твое в светле лице, да даст веселие беседующим тебе».