На измельченном материале, каким бы он внешне ни казался чистым, много микроорганизмов и плесневых грибов – конкурентов вешенки обыкновенной. При увлажнении субстрата развитие их активизируется. Самым надежным способом борьбы с нежелательной сопутствующей микрофлорой является стерилизация, однако это очень дорогостоящая операция. К тому же если после стерилизации субстрат будет помещен в нестерильные условия, микроорганизмы и плесени все равно разовьются. Следовательно, стерилизация не снимает полностью проблему уничтожения сопутствующих микроорганизмов и плесневых грибов. Однако в субстрате имеются и другие микроорганизмы, являющиеся антагонистами микроорганизмов и плесеней, вредных для вешенки обыкновенной, но их количество сравнительно невелико. Для обогащения субстрата защитными микроорганизмами исходную музейную культуру пересевают на косяки агаризованной среды. Полученную суточную культуру высевают на жидкую питательную среду, приготовленную следующим образом:
Время культивации при температуре 45 °C в аэробных условиях составляет сутки. О росте микробов свидетельствует помутнение коричневой среды. В таком виде термо-толерантные микроорганизмы можно сохранять при комнатной температуре длительный период и в любое время использовать для внесения в субстрат.
Положительное влияние защитных микроорганизмов состоит в том, что они вырабатывают антибиотическое вещество, ингибирующее развитие конкурентов вешенки обыкновенной; быстро усваивают углеводы субстрата (сахарозу, крахмал и др.), лишая конкурентов питания.
При искусственном введении защитных микроорганизмов в субстрат следует учитывать, что количество углеводов в нем зависит от вида растительных остатков, степени их зрелости, места произрастания и места хранения.
Оптимальное значение pH среды для развития защитных микроорганизмов составляет 6,0–6,5, но они неплохо развиваются и при pH 5,4–7 (приблизительно в этих пределах находятся значения pH всех растительных остатков, используемых для выращивания вешенки обыкновенной). Если субстрат имеет кислую реакцию, то с помощью гашеной извести pH доводят до необходимой величины. Защитные микроорганизмы не изменяют pH субстрата.