Стресс и патология

Инкубация в анаэробных условиях раствора аскорбиновой кислоты с NO-донорами (нитрит натрия, нитроглицерин) или с кровью больных ИБС, длительно лечившихся нитровазодилятаторами пролонгированного действия, приводит к выделению в сосудике Варбурга пузырьков газа, идентифицированного нами по реакции нитрозилирования гемоглобина как NO (рис. І-24). После смешивания и инкубации аскорбиновой кислоты с NaNO₂ в сосуде Варбурга в анаэробных условиях при 37° наблюдали выделение NO, выход которого количественно регистрировали по образованию нитрозоНв. Из сосуда Варбурга оксид азота дифундировал в кювету, содержащую раствор дезоксиНв. Содержание кюветы перемешивали с помощью магнитной мешалки для ускорения растворения газа. Постепенно дезоксиНв превращался в нитрозоНв, что сопровождалось характерными изменениями в спектре поглощения. Полоса Соре исходного дезоксиНв при 429 нм смещалась до 418 нм, а широкая асимметричная полоса поглощения с максимумом при 555–560 нм заменялась двумя полосами с максимумами при 545 и 574 нм, принадлежащими нитрозоНв (рис. І-25). В спектре поглощения гемоглобина наблюдали наличие изобестических точек при 548,5 и 565,5 нм, молярные коэффициенты поглощения (М^—1 см^—1) которых были равны соответственно 12 300 и 11 700 (рис. І-26) и использовались для количественных расчетов концентраций форм гемоглобина.

Рис. І-24. Кинетика образования нитрозогемоглобина (спектры поглощения) при взаимодействии аскорбиновой кислоты с плазмой крови больного стенокардией напряжения II ФК, получавшего нитроглицерин пролонгированного действия. Концентрация в 0,05 М натрий-фосфат– ном буфере, рН 7,4: плазмы ≈ 1,2⋅10^–4, аскорбиновой кислоты – 1,2⋅10^–4 М. Объем: 3,8 мл (в сосуде Варбурга), 5 мл Hв (10^–4 М). Время: 1 – 0′, 2 – 15′, 3 – 30′, 4 – 45′, 5 – 60′, 6 – 1,5 ч, 7 – 2 ч, 8 – 4 ч, 9 – 6 ч, 10 – 10 ч

Рис. І-25. Образование нитрозоНв из дезоксиНв (2·10^–5М) при выделении NO в результате взаимодействия аскорбиновой кислоты (3·10^–3М) и нитрита натрия (3,7·10^–2М) в анаэробных условиях. Реакция запускалась после переливания нитрита натрия (0,4 мл) из бокового отростка в центральную часть сосуда Варбурга, содержащего раствор аскорбиновой кислоты (1 мл). Спектры поглощения гемоглобина записывали через: 0 (1), 3 (2), 6 (3), 10 (4), 15 (5), 25 (6) мин после смешивания при 37 °C в натрий-фосфатном буфере, рН 7,4

Как известно, NO с высоким сродством связывается с дезоксиНв. Равновесная константа связывания NO с Нв равна 1,4×10¹² М^–1 с^–1, что более чем в 2000 раз превышает равновесную константу связывания СО с Нв.

Причем сродство NO одинаково как для α-, так и β-субъединиц [285]. Исходя из значения равновесной константы ассоциации, можно предположить, что, уже начиная с таких, практически следовых концентраций NO, как 10^–10 М, в основном весь NO будет связан с дезоксиНв. Исходя из того, что в условиях наших опытов образование нитрозогемоглобина происходило в течение нескольких минут, а равновесие устанавливается даже при концентрациях NO 10^–12 М в течение миллисекунд, то можно считать, что измеренное количество нитрозоНв отражает конечную концентрацию NO.

Рис. І-26. Зависимость образования NO (регистрация по НвNO) в реакции взаимодействия нитрата натрия с аскорбиновой кислотой от концентрации витамина С. Концентрации в 0,05 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,4: нитрита натрия – 5,7 · 10^–2, аскорбиновой кислоты – 1,5 · 10^–1 М (1), 7,5 · 10^–2 М (2), 3 · 10^–2 М (3), 3 · 10^–3 М (4), 1,2 · 10^–3 М (5), 6 · 10^–4 М (6), 310^–4 М (7). Объем: 1,4 мл (в сосуде Варбурга), 5 мл Нв (10^–4 М)

На основании полученных данных можно заключить, что витамин С принимает активное участие в обмене NO. Являясь сильным восстановителем, аскорбиновая кислота in vitro защищает оксиНв от окисления нитритом натрия и дозозависимо усиливает выделение NO из состава NaNO₂, что зафиксировано с помощью реакции нитрозилирования дезоксигемоглобина (рис. І-26), которая сопровождается характерными изменениями в его спектре поглощения (рис. І-25). Факт влияния витамина С на выделение NO из широко используемых в клинике антиангиозных препаратов in vitro доказан спектрофотометрически.

При смешивании нитроглицерина с раствором аскорбиновой кислоты происходит медленное выделение NO₂^- (NO).

Рис. І-27. Спектры поглощения дезоксигемоглобина после откачки воздуха и смешивания в сосуде Варбурга аскорбиновой кислоты (3·10^—1М) в 0,8 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера с аликвотой (0,8 мл) того же буфера. Изменение спектров записывали через 0 (1), 0,5 (2), 1 (3), 1,5 (4), 2 (5), 3 (6), 4 (7), 24 (8) часов при 37 °C

Связывание NO₂^- (NO) дезоксигемоглобином легко фиксируется по возрастанию оптической плотности раствора гемоглобина в районе 460–510 нм и ее падению при 555 нм, что свидетельствует об образовании мет– и нитрозогемоглобина в процессе длительной инкубации (рис. І-27, І-28).