Трещина в мироздании. Редактирование генома. Невероятная технология, способная управлять эволюцией

Фермент Csn1 называли по-разному, пока летом 2011-го за ним окончательно не закрепилось название Cas9. И хотя уследить за сменами его названия становилось все сложнее по мере того, как я все глубже погружалась в изучение существующей литературы о Cas9, я была уверена в неоспоримой важности этого белка. Работа Родольфа и Филиппа 2007 года показала, что дезактивация гена, кодирующего белок Cas9, нарушает способность S. thermophilus отражать атаки вирусов. Более того, когда Жозиан и Сильвен обнаружили, что геномы фагов разрезаются во время иммунного ответа CRISPR, они также открыли, что дезактивация гена, кодирующего Cas9, не дает CRISPR уничтожить вирусную ДНК. Подобным образом в опытах Эммануэль с S. pyogenes мутации в гене, кодирующем Cas9, приводили к дефектам в выработке молекул РНК CRISPR и в целом вредили работе иммунной системы. Наконец, результаты работы, проведенной Родольфом и Филиппом осенью 2011 года в лаборатории Виргиниюса Шикшниса, предполагали, что cas9 – единственный известный рабочий cas-ген в системе CRISPR S. thermophilus, абсолютно необходимый для противовирусного ответа.

Чем больше я читала об этом, тем яснее становилось, что белок Cas9, скорее всего, играет ключевую роль на том этапе иммунного ответа систем CRISPR II типа, который связан непосредственно с разрушением ДНК. Это белок был совершенно необходим в бактериях рода Streptococcus, однако казалось разумным, что любой критически важный компонент одной из групп систем II типа будет критически важен и для всех других. Однако какую именно роль играл Cas9, еще только предстояло определить.

Мы с Мартином позвонили Эммануэль по скайпу, чтобы начать строить стратегию наших экспериментов с Cas9. Выбрать момент для этого звонка было непросто, и это лишь подчеркивало организационные сложности нашего сотрудничества. Сама Эммануэль находилась в университете Умео в Северной Швеции, в десяти часовых поясах от Калифорнии, а Кшиштоф Чилински, аспирант, отвечавший за проект ее лаборатории по изучению CRISPR, работал в Венском университете (где раньше располагалась лаборатория Эммануэль). В общем, нам предстояло согласовать работу международной команды: французский профессор в Швеции, польский аспирант в Австрии, а в Беркли – немецкий магистрант, чешский постдок и американский профессор.

Когда удобное для всех время было найдено, мы начали в общих чертах обсуждать предстоящий проект. Мы у себя в лаборатории сначала представляли себе движение к цели весьма прямолинейным: нам нужно понять, как выделить и очистить белок Cas9, – чего пока не смогли сделать в лаборатории Эммануэль. Получив белок Cas9, мы могли бы начать биохимические опыты, чтобы узнать, взаимодействует ли Cas9 с РНК CRISPR (мы предполагали, что да), а также понять, что он делает во время противовирусного иммунного ответа.

Кшиштоф, магистрант Эммануэль, прислал нам искусственную хромосому, содержащую ген cas9 из S. pyogenes, а Михи принялся за работу над очищением белка под пристальным контролем Мартина. Сначала Михи помещал синтетическую ДНК в различные штаммы E.coli, а затем, варьируя условия роста и типы питательных сред, последовательно проверил десятки различных параметров, чтобы подобрать протокол, при котором получается максимальное количество белка Cas9 (словно садовник, пробующий различные комбинации почв и удобрений, чтобы определить оптимальные условия для роста нового цветка). Затем с помощью хроматографии (эта технология позаимствована из химии) Михи протестировал различные методы “вскрытия” клеток и отделения Cas9 от других клеточных белков. Наконец, он определил стабильность очищенного белка Cas9. Некоторые белки капризнее других и портятся после одного лишь применения – обычно они слипаются друг с другом и выпадают в осадок, подобно микроскопическим снежинкам, из-за чего совершенно прозрачная пробирка с белковым раствором становится молочного цвета. Другие же молекулы демонстрируют замечательную выносливость – например, их можно неоднократно замораживать и размораживать. Нам повезло: Cas9 относился ко второй категории.

Наконец, пришло время провести первый биохимический опыт. Когда Михи и Мартин выделяли и очищали белок Cas9, мы предположили, что проявление любой связанной с разрезанием ДНК активности, свойственной конкретному белку, зависит от наличия РНК CRISPR. В системах CRISPR I типа, которые изучали в нашей лаборатории, РНК CRISPR собиралась вместе с множеством Cas-белков для формирования машины для соединения с ДНК и ее разрезания. Мы предполагали, что Cas9 может работать с РНК CRISPR подобным образом. В соответствии с этой идеей компьютерный анализ последовательности аминокислот Cas9 показал возможное присутствие не одной, а двух отдельных структур для разрезания нуклеиновых кислот, или нуклеаз, внутри фермента. Возможно, один или оба эти участка были способны резать ДНК фага.