Трещина в мироздании. Редактирование генома. Невероятная технология, способная управлять эволюцией

Получив результаты работы Мартина и Кшиштофа, мы были готовы заняться следующим вопросом: если бактерия могла запрограммировать Cas9 на разрезание специфических последовательностей ДНК вирусов, можем ли мы, как и предполагали раньше, запрограммировать Cas9 на разрезание других последовательностей ДНК, не обязательно вирусных? Мы с Мартином были хорошо осведомлены о достижениях в области редактирования генома и о возможных перспективах – а также существенных ограничениях – программируемых нуклеаз на основе ZFN и TALEN. Мы осознавали – и были поражены этим, – что обнаружили систему, на основе которой можно построить самый простой метод редактирования генома из всех, что были открыты и разработаны до сих пор.

Но чтобы превратить эту крошечную молекулярную машину в мощный инструмент редактирования генома, предстояло сделать еще один шаг. К тому времени мы уже разобрали сложный иммунный ответ на простые части, которые можно разделять, изменять и комбинировать по-разному. Более того, тщательно проведя биохимические эксперименты, мы установили молекулярные правила, управляющие функциями этих различных частей. Теперь же мы хотели удостовериться, что можем видоизменять Cas9 и молекулы РНК для нацеливания на любую выбранную последовательность ДНК и для ее уничтожения. Если сможем – значит, CRISPR поистине мощный инструмент.

Процесс программирования машины CRISPR-Cas9 на самом деле состоял из двух этапов: из проработки идеи и собственно эксперимента. Сначала, конечно, идея. Мартин со своей обычной дотошностью методично модифицировал обе молекулы РНК – молекулу РНК CRISPR, отвечающую за наведение на цель, и молекулу трансактивационной РНК, которая удерживает вместе молекулы РНК CRISPR и Cas9 (с тем чтобы определить, каким образом каждая “буква” каждой РНК влияет на ее функции). На основе этой информации мы с Мартином придумали способ слить две молекулы РНК в одну. Если соединить конец одной молекулы с началом другой, то итоговая гибридная РНК – если она вообще окажется работоспособной – поможет нам упростить машину для нарезки ДНК, которую мы программируем: нам не придется добавлять к Cas9 две молекулы РНК – гида (РНК CRISPR) и помощника (трансактивационную РНК). Вместо этого мы сможем использовать фермент в сцепке с единственной молекулой РНК – РНК-гидом, который выполнял бы обе задачи. Снижение сложности системы сильно повысило бы удобство ее применения.

Мы продумали эксперимент в соответствии с этой идеей. Нам нужно было проверить, может ли одна эта гибридная молекула РНК все так же направлять Cas9 к подходящей последовательности ДНК для разрезания последней. Также наш эксперимент должен был показать, действительно ли Cas9 можно запрограммировать на разрезание любой желаемой последовательности ДНК (как мы предполагали), а не только тех последовательностей ДНК фагов, которые были естественным путем отобраны системой CRISPR в ходе эволюции бактерий.

Исходя скорее из удобства, чем какого-либо предпочтения, – мы понимали, что совершили серьезный прорыв, и не хотели откладывать эксперимент из-за того, что под рукой нет подходящего гена, – мы решили использовать ген медузы, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP). Этот белок широко используется в лабораториях по всему миру для визуализации клеток и белков в их составе и стал настолько важным биотехнологическим инструментом, что в 2008 году принес группе ученых: Мартину Чалфи, Осаму Симомуре и Роджеру Тсиену – Нобелевскую премию по химии. Мартин Йинек выбрал пять различных последовательностей длиной в двадцать “букв” внутри гена-мишени и затем создал пять гибридных молекул РНК, точно совпадающих с ними. Как только гибридные РНК-гиды были готовы, мы использовали их вместе с Cas9 и ДНК медузы в уже привычном для нас опыте по разрезанию ДНК и стали ждать результатов.

Когда Мартин показал мне результаты эксперимента с GFP на одном из лабораторных компьютеров, рентгенограмма на экране монитора выглядела замечательно. Все ДНК GFP были разрезаны в заданных местах. Каждая гибридная молекула РНК сработала именно так, как нужно, выбрав именно тот участок ДНК медузы, который мы хотели надрезать и в паре с Cas9 разбить ее именно в том месте.

Программируемая нарезка ДНК посредством CRISPR-Cas9

Мы сделали это. За короткое время мы создали и протестировали новую технологию, которая, основываясь на исследованиях белков ZFN и TALEN, давала возможность редактировать геном – любой геном, а не только геномы бактериофагов. Из этой пятой системы вооружения бактерий мы сделали средство для переписывания кода жизни.