Трещина в мироздании. Редактирование генома. Невероятная технология, способная управлять эволюцией

Как мы предполагали, использование CRISPR в человеческих клетках подтвердит широту возможностей этого нового способа редактирования генов. И для этих предположений были веские причины. Наше собственное исследование показало, что белок Cas9 и его направляющая РНК очень избирательны и крепко связаны друг с другом, а это свидетельствует, что они без проблем найдут друг друга в человеческой клетке. А что касается отправки их в клеточное ядро, где расположена ДНК, то тут нам достаточно присвоить этим молекулам подходящий химический “адрес получателя”, и клетка сама сделает остальную работу за нас. До этого сотрудники многих лабораторий преуспели в переносе белков и молекул РНК от бактерий в клетки человека, и в нашем распоряжении было немало молекулярно-биологических инструментов, которые помогли бы CRISPR работать должным образом и за пределами его обычных мест обитания.

Нам оставалось только показать, что все работает именно так, как мы и предположили.

Мартин начал с переноса бактериальной ДНК, кодирующей Cas9, и синтезированной на основе информации от CRISPR РНК в две плазмиды – небольшие колечки ДНК, которые ведут себя как искусственные мини-хромосомы. Первая плазмида содержала генетические инструкции для направляющей РНК, а также отдельные инструкции для человеческих клеток, чтобы они тоже понемногу производили такие молекулы РНК. Во второй плазмиде находился ген cas9, но он был “гуманизирован”[80], чтобы его могли прочесть белок-синтезирующие аппараты человеческих клеток. Мартин также слил с геном cas9 еще два гена, часто используемых биологами: один, совсем небольшой, под названием клеточный сигнал ядерной локализации, направляющий белок в клеточное ядро, и ген зеленого флуоресцентного белка, благодаря которому каждая человеческая клетка, производящая белок Cas9, должна была засветиться зеленым, если на нее подействовать ультрафиолетом.

Соединив все эти молекулярные компоненты в единую систему, мы с Мартином намеревались превратить человеческие клетки в фабрики для производства CRISPR, которые, сами того не ведая, штампуют молекулы, запрограммированные на разрезание заданных частей собственного генома. И еще мы знали, что CRISPR не убьет человеческие клетки “шинкованием” ДНК, как он делает это с вирусами в бактериях, разрезая вирусную ДНК. ДНК человека (да и всех эукариотических организмов, если уж на то пошло) постоянно получает повреждения – например, это происходит, когда она подвергается воздействию канцерогенных веществ, ультрафиолета либо рентгеновского излучения. И чтобы приводить в порядок поврежденную ДНК, клетки разработали хитроумные системы репарации двуцепочечных разрывов в ней. Таким образом, в самом вероятном сценарии, если CRISPR вырежет нужный ген, клетка ответит на это просто “склеиванием” фрагментов молекулы ДНК обратно в единое целое, будто приварит одну металлическую трубу к другой. Ученые именуют этот процесс негомологичным соединением концов, ведь он, в отличие от гомологичного, не требует ДНК-шаблонов для починки молекулы. (Слово “гомологичный” происходит от греческого homologos, означающего “согласный с законом”.)

Ключевая особенность этого процесса репарации – заложенная в самой его природе небрежность. Как сварщик перед работой должен удостовериться, что у обеих труб очищены торцы, подлежащие сварке, так и клетке перед соединением фрагментов разорванной ДНК тоже нужно убедиться, что концы этих фрагментов чистые. Создание чистых концов иногда требует удаления или вставки нескольких “букв” ДНК, что приводит к изменениям состава генов после окончания процесса репарации. Это означает, что ген, скорее всего, изменится после “атаки” и вырезания его CRISPR и последующей починки за счет клетки. Этот неточный и порождающий ошибки способ репарации должен был обеспечить нам с Мартином простой метод выявления успешных попыток редактирования генов. Выбирая в качестве мишени конкретный ген и анализируя последовательность его нуклеотидов буква за буквой до воздействия CRISPR и после него, мы могли бы найти любой признак неаккуратной репарации, а это доказало бы, что CRISPR обнаружил свою цель и разрезал ее.