Ваниль

С другой стороны, было показано (Odoux et al., 2003), что глюкованилин обнаруживался только во внутренней части плода и, в основном, присутствовал в семяносце и, в меньшей степени, в сосочках (рис. 10.10b). В более подробном исследовании (Odoux и Brillouet, 2009) оказалось, что, с учетом массового соотношения различных тканей и соответствующего содержания, глюкованилина в семяносце 92,2%, по сравнению с 7% в сосочках и 0,8% в мезокарпе. Глюкованилина не нашлось во внутриполостном пространстве вокруг семян, за исключением следов (которые могли быть артефактами).

Эти же авторы (Odoux et al., 2003) обнаружили, что активность глюкозидазы была намного выше в семяносце, чем в мезокарпе или сосочках (выраженная как общая активность на единицу массы свежей ткани). Распределение активности β-глюкозидазы, выраженное в процентах от максимального значения, оказалось следующим (Odoux and Havkin-Frenkel, 2005): 11% в мезокарпе, 100% в семяносце и 20% в сосочках (рис. 10.10b). Другими словами, существует почти идеальная суперпозиция между распределением глюкованилина и ферментативной активностью. В результате ферменту и глюкованилину не нужно распространяться в тканях плода для возникновения гидролиза (см. также главу 11).

Другие исследования (Joel et al., 2003; Havkin-Frenkel et al., 2005) подтвердили, что глюкованилин присутствует в светлой, внутренней части плода (в семяносце и сосочках). Они также предположили присутствие глюкованилина во внутриполостном пространстве (рис. 10.10c) – результат, получен при окрашивании катехином-HCl, после его биосинтеза (см. ниже) и выведения сосочками.

Однако, было найдено уменьшение градиента ферментативной активности (выраженной как удельная активность) от внешней части к внутренней области семяносца (Havkin-Frenkel et al. 2005). Распределение активности β-глюкозидазы, выраженное в процентах от максимального значения, было следующим (Odoux and Havkin-Frenkel, 2005): 100% в зеленой внешней ткани плода, 43% в ткани семяносца и 15% в в волосовидных клетках (рис. 10.10c). Эти результаты, которые диаметрально противоположны результатам Арана (Arana, 1943), также пришли к выводу, что глюкованилин или фермент должны распространяться через ткани стручка для его полного гидролиза.

Важно отметить, что результаты относительно тканевой локализации ферментативной активности (Havkin-Frenkel et al., 2005; и Odoux et al., 2003) не обязательно противоречат друг другу. Действительно, удельная активность – это соотношение между общей активностью и содержанием белка, и это содержание белка намного выше в семяносцах, чем в мезокарпе (Odoux and Brillouet, 2009). В таком исследовании, выражать ферментативную активность как удельную активность (Havkin-Frenkel et al., 2005) – бесполезно и может привести к неправильной интерпретации.

На клеточном уровне активность глюкозидазы локализована в цитоплазме или апоплазме (рис. 10.11). Однако, она не является ни вакуолярной, ни париетальной (Odoux et al., 2003). Глюкованилин не присутствовал, но различные соображения (концентрация обычно около 300 мМ и объемные соотношения клеточных компартментов) предполагают, что он может присутствовать в вакуоли (рис. 10.11), которая является предпочтительным компартментом для хранения вторичных метаболитов (Boudet et al., 1984; Wink, 1997; Beckman, 2000; Bartholomew et al., 2002). Предполагается, что он также может присутствовать во внеклеточной области вокруг семян (Joel et al., 2003), но полученные результаты (Odoux и Brillouet, 2009), противоречат этой гипотезе.

РИСУНОК 10.11. Клеточная локализация активности глюкованилина и β-глюкозидазы согласно Odoux et al., 2003.

Несмотря на значительные разногласия и путаницу, локализация активности глюкованилина и глюкозидазы на тканевом уровне теперь уточнена. Остается определить, присутствует ли глюкованилин во внутриполостном пространстве вокруг семян, что может иметь важное значение для подтверждения возможной тканевой специализации в биосинтезе глюкованилина (см. ниже).

На клеточном и субклеточном уровнях локализацию β-глюкозидазы можно уточнить с помощью такого метода, как иммунолокализация. Аналогичным образом, еще предстоит определить клеточную локализацию глюкованилина.

Накопление глюкованилина и β-глюкозидазы во время развития стручков ванили

Другая область, в которой проводилось очень мало исследований – это эволюция глюкованилина и активности β-глюкозидазы во время развития стручков, и еще меньше исследований было проведено по их эволюции в зависимости от типа ткани.

Единственная точка согласия, которая возникла в результате различных исследований эволюции глюкованилина (Ranadive et al., 1983; Sagrero-Nieves and Schwartz, 1988; Kanisawa et al., 1994; Brodélius, 1994; Havkin-Frenkel et al., 1999) заключается в том, что накопление ванилина или глюкованилина в плодах начинается с 15-й недели после опыления и продолжается примерно до 30-й недели.