Ваниль

Для активности β-глюкозидазы невозможно сравнить значения, приведенные в библиографии, из-за используемых средств (единиц) выражения, протоколов получения экстрактов ферментов, природы используемых буферов (pH, ионная сила и т. д.), молярности субстрата (обычно p-нитрофенил-глюкуронид) и так далее. Наш собственный опыт в этой области показал, что в зрелых зеленых стручках с физиологически здоровым внешним видом и стандартизированным точным протоколом (Odoux, 2004) эта активность также может значительно варьироваться. Для примерно 100 плодов урожая Мадагаскара 2000 года, активность β-глюкозидазы колебалась от 100 до 2000 нкатал/г свежего веса, при этом большинство отдельных стручков проявляли активность около 1000 нкатал/г свежего веса (неопубликованные результаты).

Более систематические исследования эволюции глюкованилина (и других глюкозидов) и активности глюкозидазы во время развития стручков необходимы для подтверждения или опровержения уже опубликованных исследований. В случае ароматических компонентов должны быть установлены очень строгие аналитические протоколы, чтобы устранить любую двусмысленность в отношении формы, в которой они присутствуют на различных стадиях развития. Также было бы полезно стандартизировать анализы активности глюкозидазы, для которых результаты почти никогда нельзя сравнивать от одного исследования к другому.

Эти изменения также следует измерять по типу ткани; в случае глюкозидов это может позволить получить дополнительную информацию о путях и местах биосинтеза этих компонентов (см. следующий раздел).

Место биосинтеза и метаболический путь для глюкованилина

В своей работе по биосинтезу ванилина Лекомт пришел к выводу, что в нем участвует «кониферозид» (кониферин), производящий конифериловый спирт путем ферментативного гидролиза, который затем превращался в ванилин под действием «оксидазы» (Lecomte, 1901, 1913). Горис, который выделил «ванилозид» (глюкованилин) в 1924 году, предположил, что второй возможный путь заключался в представлении действия «оксидазы» перед действием «гидролазы» (рис. 10.12). Не имея возможности выделить ни «кониферозид», ни конифериловый спирт, он в конце концов пришел к выводу, что эти гипотезы не подтверждаются (Goris, 1947). Однако, позже они были возобновлены Анваром (Anwar, 1963).

РИСУНОК 10.12. Биосинтетический путь ванилина, предложенный Лекомтом (Lecomte, 1901, 1913) и Горисом (Goris,1947).

Сейчас принято считать, что ванилин является продуктом биосинтетического пути шикимовой кислоты через фенилаланин, который приводит к фенилпропановым соединениям посредством ферментативного дезаминирования и, прежде всего, к коричной кислоте (рис. 10.13). Последовательные ферментативные гидроксилирования и метилирования затем ведут к образованию пара-гидроксикоричных кислот и, в частности, кумаровой, кофейной, феруловой и синапиновой кислот.

РИСУНОК 10.13. Предполагаемый путь биосинтеза соединений фенилпропана через шикимовую кислоту и l-фенилаланин. (Данные Odoux, E., Fruits, 61, 171–184, 2006.)

Большинство исследований, опубликованных в попытке прояснить последующие этапы пути биосинтеза ванилина, было проведено с использованием клеточных культур и показало, что различные пути могут быть активированы в зависимости от экспериментальных условий (обзор Dignum et al., 2001; Walton et al., 2003). Поэтому трудно сделать какие-либо окончательные выводы и еще труднее попытаться экстраполировать результаты, полученные в этих условиях, на растение.

Что следует из исследований, проведенных на плодах, о которых имеется очень мало информации (Zenk, 1965; Kanisawa, 1993; Kanisawa et al., 1994; Negishi et al., 2009), так это то, что предполагаются два пути биосинтеза:

• Первый предполагает, что прямым предшественником ванилина является феруловая кислота (соединение C6-C3). Это означает, что боковая цепь C3 молекулы позже укорачивается до ванилина (соединение C6-C1) (рис. 10.14). Это аргумент, выдвинутый Зенком (Zenk, 1965) и подтвержденный недавней работой Негиши (Negishi et al., 2009). В обоих случаях результаты были получены после внедрения помеченных ¹⁴C молекул в зеленые ванильные диски и мониторинга их превращения.

РИСУНОК 10.14. Биосинтетический путь ванилина, предложенный Зенком (Zenk, 1965) и Негиши (Negishi et al., 2009).

Результаты, полученные Негиши (2009) также предполагают, что биосинтез не вызывает вмешательства глюкозилированных промежуточных соединений. Таким образом, ванилин синтезируется в форме агликона, а затем глюкозилируется после образования.