Овладев Азовом, донцы приступили к восстановительным работам, стараясь не столько возобновить старые укрепления, сколько еще более усилить их. Превратив город в свою базу, казаки уже в следующем, 1640 г. направили в море к крымским берегам флотилию из 37 стругов, которая была встречена большим османским флотом, насчитывавшим 80 галер — «каторг» и 100 малых судов — «ушкулов». Бои между казачьими и турецкими кораблями шли три недели (!). Казаки повредили 5 галер противника, но, преследуемые турецкими кораблями, вынуждены были высадиться на берег и по суше возвратиться в Азов.
Намерение турок любой ценой вернуть себе Азовскую крепость не являлось тайной для донских атаманов. Об этом сообщали взятые в плен «языки». Ожидая прихода неприятельской армии, казаки продолжали укреплять свою новую столицу, готовили воинские припасы и провиант. Им вновь помогло русское правительство, накануне вражеского нападения направившее в Азов 4 тыс. четвертей ржаной муки, 350 четвертей овсяной крупы, 350 четвертей толокна, 300 четвертей сухарей и большую денежную казну (8 тыс. рублей). Помимо малых пищалей в крепости находилось 7 больших пушек, для которых еще в 1639 г. из Москвы было доставлено 350 железных ядер.
В конце 1640 — начале 1641 г. обстановка в Приазовье начала сгущаться. Закончив войну с Ираном новый султан Ибрагим I решил нанести мощный удар по донским казакам. Повинуясь его приказу, войско крымского хана Бегадыр-Гирея в начале января 1641 г. начало нападать на стоявшие под Азовом казачьи отряды. В пятидневном сражении донцы были разбиты, после чего противнику удалось прервать сообщение донцов с Воронежом, откуда к ним поступали хлебные запасы. По этой причине в 1640 и 1641 гг. на Дон не было прислано царского «зелейного» и «хлебного» жалованья. В канун вражеского нашествия казакам удалось переправить лишь денежную казну — 6000 руб. в 1640 г. и 8000 руб. в 1641 г.
Крымская блокада Азова предшествовала большому походу турецкой армии и флота. Весной 1641 г. султан Ибрагим направил к устью Дона флот, состоявший из 70 «каторг» и 90 «ушкулов» (по другим, по-видимому, преувеличенным сведениям у противника было 100 галер, 80 больших и 90 малых «ушкулов) и 30-тысячную турецкую армию Дели-Гуссейн-паши». Подошедшая туда 40-тысячная крымская орда участия в осаде не принимала. Лишь на минных работах были задействованы крымские сеймены (стрельцы). Почти все они погибли при взрыве осажденными турецких подземных работ.
Осада началась 7 июня 1641 г. и продолжалась почти 4 месяца. Укрепления Азова обстреливало 129 больших «проломных» пушек, стрелявших ядрами весом не менее пуда, и 32 «верховые» пушки (мортиры), на случай вылазки осаждающие установили в своих траншеях 674 небольших орудия, скрепленных между собою цепями. Казаки под командованием атамана Осипа Петрова и Наума Васильева (5367 мужчин и 800 женщин) отбили 24 приступа врага. Во время первого штурма осажденные использовали заранее установленные на вероятном направлении атак противника пороховые мины, с помощью которых был взорван Топраков город (Земляной город) — предместье Азова. Турки попытались подвести к стенам крепости земляной вал, подобный тому, с помощью которого они незадолго до этого взяли Багдад. Но и эти работы были взорваны осажденными. Неудачей закончилась и многодневная бомбардировка Азова. Казаки достаточно легко перенесли продолжавшийся 16 суток обстрел крепости из тяжелых орудий, отсидевшись «в четвертом земляном городе и в земляных избах». Встревоженный неудачным ходом осады и большими потерями своей армии Дели-Гуссейн-паша направил султану послание с просьбой прекратить осаду и отвести войска, чтобы лучше подготовиться к новому нападению. Начать его турецкий командующий предлагал следующей весной. Однако Ибрагим отверг его доводы и прислал военачальнику краткий ответ с решительным приказом: «Паша, возьми Азов или отдай свою голову». Все же в ночь с 25 на 26 сентября 1641 г. Дели-Гуссейн-паша был вынужден нарушить повеление султана и снять осаду, продолжавшуюся 93 дня. В боях и на штурмах его войска понесли тяжелые потери: погибло 15 тыс. турецких пехотинцев, 3 тыс. моряков, 7 тыс. татар. Но и казакам победа досталась дорогой ценой — около половины их (3 тыс. человек) погибла, а почти все оставшиеся в живых были ранены.