Мазепа отягощен думами. Мария приходит к нему с ласками, он не отвечает на них. Тогда Мария начинает упрекать его в том, что он ее не любит.
Мазепа пытается разуверить ее. Но Мария не верит. Говорит, что он совсем ее позабыл – то в разъездах, то с военачальниками, то с иезуитом. Подозревает, что причиной тому – какая-то женщина. Отговорки гетмана не действуют, и Мария настаивает на том, чтобы Мазепа открыл причину своей озабоченности. Мазепа признается, что в настоящий момент «кипит дело», которое давно он и его сторонники замыслили. Дело это в завоевании независимости Украины – и от Варшавы, и от Москвы. Княгиня Дульская (к которой ревнует Мария) и «оба короля» – союзники Мазепы в этом замысле и готовы выступить против Петра. Мария одобряет его стремление к трону – трону независимого государства. Мазепа говорит, что все может кончиться и плахой. Мария отвечает, что пойдет с ним на плаху. Клянется ему в любви. Тогда Мазепа спрашивает, кто ей дороже – супруг или отец. Мария недоумевает, Мазепа настаивает на ответе. Мария говорит, что для него готова пожертвовать всем. Мазепа просит ее запомнить эти слова.
В замке, однако, смятенье, так как утром должна состояться казнь «доносчиков».
Кочубей сидит в тяжком раздумье в темнице. Смерть ему не страшна, ему лишь невыносима мысль, что он умрет неотомщенным. Он вспоминает свою прошлую жизнь, Полтаву, дочь…
В замке гремит ключ, Кочубей ожидает увидеть исповедника, но к нему входит «свирепый Орлик». На вопрос, что им еще от него надо, Орлик говорит, что гетман требует «еще признанья» – где именно зарыты клады, которые Кочубей, по их сведениям, схоронил в Диканьке, так как кроме имения, которое теперь поступит в казну, гетман хочет получить и эти деньги. Кочубей отвечает:
Орлик говорит, чтобы Кочубей прекратил свои «бредни», угрожает пыткой. Кочубей просит оставить его в покое, говорит, чтобы о кладах спросили его дочь. Орлик зовет палача.