Тем временем Мазепа не спит. Он смотрит на спящую Марию, думает, что ее отец будет казнен, что чем ближе цель (трон), тем тверже должен он быть. Однако он опасается, как поведет себя Мария, когда узнает о казни своего отца. Жалеет, что связал себя любовью, ужасается, каким ударом будет для Марии, пожертвовавшей всем для него, весть о казни отца. Мазепа выходит в сад, ему не спится.
Наступает утро. Мария просыпается, ожидает увидеть рядом Мазепу, но перед ней стоит мать. Мать тайно проникла к дочери, чтобы та попросила о смягчении участи своего отца – чтобы казнь была отменена. Мария не понимает, какая казнь, мать ей все рассказывает. Мария падает без чувств.
Народ собирается в поле возле помоста, на котором должна состояться казнь. Приезжает гетман. Затем появляется телега с Кочубеем и Искрой. Люди молятся, осужденные всходят на помост.
После казни «народ беспечный» идет домой, говоря о своих повседневных делах и заботах. На телегу поднимают трупы. В это время прибегают две женщины – Мария и ее мать. Им говорят, что «поздно».
Мазепа приезжает домой, спрашивает Марию, но ее нигде нет. Ее начинают искать. Идет время, но Мария не появляется. Гетман запирается в своих покоях, проводит ночь без сна. Утром возвращаются слуги на уставших взмыленных конях: их поиски окончились безрезультатно.
Несмотря на душевную печаль, гетман продолжает свои сношенья со шведским королем. Но чтобы скрыть свою активность, он прикидывается больным, жалуется на старость, немощь, даже призывает духовника. Время шло.
Украина встревоженно зашумела, народ начинает подниматься на войну.
Узнав о предательстве Мазепы, Петр приходит в ярость. В соборах его предают анафеме. Петр призывает семейства Искры, Кочубея, осыпает их милостями. Из ссылки призван и враг Мазепы Палей.
Войска Петра подходят к Полтаве. С другой стороны – войска Карла и Мазепы. Наутро должен состояться бой. Шведы спят, готовясь к битве. Только Мазепа не спит, беседует с Орликом. Он сетует, что они слишком поторопились, предвидит поражение. О Карле Мазепа говорит:
Орлик говорит, что еще не поздно переметнуться на сторону Петра. Мазепа отвечает, что примирение невозможно. Признается, что еще под Азовом, во время пира сказал смелое слово царю, а тот оттаскал его за усы. Смирившись тогда с унижением, Мазепа дал сам себе клятву отомстить Петру. С тех пор он носил в себе злобу «как мать во чреве младенца носит». Мазепа считает, что послан Петру в наказанье, называет себя «терном в листах его венца». Добавляет, что унижений больше не потерпит ни за какие посулы и что кому кого держать за усы, решит заря.