Наиболее значительные и драматические события в истории Александровской слободы связаны, несомненно, с именем царя Ивана IV Грозного, который почти два десятилетия (1564—1581) пытался заставить всех воспринимать ее как фактическую невенчанную столицу России. Принципиальные изменения в жизни Александровской слободы в XVI в. начались именно в период опричнины. (Так назывался удел Ивана Грозного в 1565—1572 гг. с особой территорией, войском, государственным аппаратом. Опричнину понимают и как систему внутриполитических мер Ивана Грозного в эти более чем 7 лет для борьбы с предполагаемой изменой в среде феодалов, практикой массовых репрессий, казней, земельных конфискаций и т. п.) Почти на два десятилетия в XVI в. Александровская слобода чуть ли не затмила Москву. Здесь находилась резиденция царя Ивана Грозного, ставшая по его желанию политическим, экономическим и культурным центром Русского государства и центром введенной им опричнины.
В период опричнины Александровская слобода и ее ближайшие окрестности превратились в строго охраняемую зону. Все подъезды и подходы к Александровской слободе строго контролировались. На расстоянии 3 версты (3,2 км) от слободы были поставлены заставы, въезжать и выезжать через них мог только тот, кто имел разрешение Ивана Грозного. Александровская слобода с царским комплексом превратилась в укрепленную крепость-монастырь с земляным валом и рвом. В царском комплексе было создано особое монастырское опричное братство во главе с игуменом Иваном Грозным численностью около 300 человек. На каждом из них поверх оружия и светской одежды была черная ряса. Лицемерное благочестие царило в слободе. Опричники, «братия», в полночь и в 4 часа утра собирались в церкви на богослужение, в 8 часов была общая трапеза, Иван Грозный читал вслух псалмы. О жизни тогда в Александровской слободе историк Н.М. Карамзин писал так: «…Царь устроил дикую пародию монастыря, подобрал три сотни отъявленных опричников-головорезов, которые составили братию, сам же царь принял звание игумена. Этих штатных разбойников царь обрядил в скуфейки и рясы, сочинил для них монастырский устав, сам с царевичами лазил на колокольню звонить к заутрене, в церкви читал и пел на клиросе и клал такие земные поклоны, что со лба его не сходили кровоподтеки. После обедни братия обжиралась и опивалась, а царь одиноко обедал сам и принимался за чтение поучений отцов церкви о посте и воздержании, дремал или шел в застенок присутствовать при пытках подозреваемых».
Современному человеку трудно понять поведение Ивана Грозного в период опричнины. Но если вспомнить, что оспаривалась законность даже его царского происхождения (ставилось под сомнение его рождение от Василия III), его долгое противоборство с боярами-княжатами, необходимость любой ценой усилить вертикаль центральной царской власти, а в конце 1564 г. угрозу России от Польши и ее союзника – сильного крымского хана, а также важность получить широкий выход для России к Балтийскому морю и связанные с решением этой задачи тяжести Ливонской войны (1558—1583), то только можно удивляться, как у Ивана Грозного хватало сил на решительные действия, поддержку многих прогрессивных начинаний, новаций и добрых дел (строительство и украшение монастырей, храмов, создание первых типографий, водопровода в Москве, развитие в ней аптечного дела, интерес к учености, книгам, музыке, культуре и шахматам, укрепление армии и многое другое).
Иван Грозный был убежденным православным россиянином, прогрессивным и смелым реформатором, одним из самых образованных людей своего времени, поразительным эрудитом, страстным любителем музыки, хорового пения, книг, скорее всего и талантливым композитором, поэтом, певчим, хотя и крайне жестким политиком и правителем, очень властолюбивым, своенравным, болезненно мнительным, подозрительным человеком с массой дурных наклонностей. Именно при нем, именно в Александровской слободе проявились многие новшества, ранее не известные в России (см. стр. 239). Иван Грозный в Александровской слободе занимался государственными делами, принимал иностранных послов, устраивал пиры, охотился, вершил суд и карал неугодных людей, хранил богатейшую библиотеку, равной которой тогда не было в других странах (эту знаменитую библиотеку из древних рукописных книг на греческом, латинском, еврейском языках привезла в Россию бабка Ивана Грозного, племянница византийского императора Софья Палеолог в качестве приданого).