В 1598 году, после смерти царя Фёдора Ивановича, Шуйский и по знатности своего рода, и по близости к пресекшейся династии казался наиболее верным претендентом на трон. Но царём стал Борис Годунов. В 1604 году, после того как в русских пределах появился претендент, называвший себя царевичем Димитрием, Шуйский на Красной площади при большом стечении народа несколько раз повторил, что это несомненный самозванец, так как сам он своими руками погребал в Угличе настоящего царевича. Успокоенный этими заверениями Годунов в январе 1605 года послал Шуйского с войском против «Дмитрия». Шуйский сразился с претендентом и нанёс ему поражение при Добрыничах. Но потом война приняла затяжной характер. Между тем Борис Годунов умер. В мае 1605 года всё войско присягнуло «царевичу».
Шуйский вместе с другими боярами также признал Дмитрия царём. Впрочем, он ни минуты не сомневался, что имеет дело с самозванцем. 20 июня Дмитрий въехал в Москву, а уже 23-го Шуйского схватили за крамолу. Донесли, что он объявил торговому человеку Фёдору Коневу и какому-то Косте-лекарю, что новый царь не является сыном Грозного, и поручил им разглашать это тайно в народе. Дело, однако, быстро вышло наружу, и Дмитрий велел судить Шуйского Земскому собору. По свидетельству наших летописей, князь Василий в этих трудных обстоятельствах держался с твёрдым достоинством. Он не только не отрёкся от своих слов, но даже под пыткой продолжал повторять, что под личиной Дмитрия скрывается самозванец. Он не назвал никого из своих соумышленников и был один приговорён к смертной казни: братьев его лишили только свободы. 25-е число назначено было для исполнения приговора. Шуйский был вывезен к плахе, уже прочитана была ему сказка, или объявление вины, уже простился он с народом, объявив, что умирает за правду, за веру и народ христианский, как прискакал гонец с объявлением помилования. Казнь заменена была ему ссылкой. Но и это наказание не было исполнено. 30 июля, венчаясь на царствие, Дмитрий объявил прощение всем опальным. В числе прочих вернулись и Шуйские, которые, кажется, даже не успели доехать до места ссылки. Им было возвращено боярство и все их вотчины. Утвердившись в прежней власти, князь Василий Иванович немедленно возобновил и свои интриги. Но теперь он действовал осторожнее и готовил переворот более тщательно.
Вскоре к заговору пристали князья Василий Васильевич Голицын и Иван Семёнович Куракин. Бояре положили между собой прежде всего убить царя, а потом уже решать, кто из них будет править. При этом поклялись, что новый царь не должен никому мстить за прежние досады, но по общему совету управлять Российским царством. Условившись со знатными заговорщиками, Шуйский стал подбирать других, из народа, успел привлечь на свою сторону 18-тысячный отряд новгородского и псковского войска, стоявший возле Москвы и назначенный к походу на Крым. Около четырёх утра 17 мая 1606 года ударили в колокол на Ильинке, у Ильи Пророка, на новгородском дворе, и, разом заговорили все колокола московские. Толпы народа хлынули на Красную площадь; там уже сидели на конях бояре и дворяне, числом до двухсот, в полном вооружении. Не дожидаясь, пока соберётся много народу, Шуйский в сопровождении одних приближённых въехал в Кремль через Спасские ворота, держа в одной руке крест, в другой меч. Подъехав к Успенскому собору, он сошёл с лошади, приложился к образу Владимирской Богоматери и сказал окружающим: «Во имя Божие идите на злого еретика». Толпы двинулись ко дворцу. Дмитрий, узнав в чём дело, перебежал по галерее к каменному дворцу, хотел по подмосткам спуститься на землю, но упал с высоты 15 сажен во двор и сильно разбился. Стрельцы, не бывшие в заговоре, подобрали его, сначала не хотели отдавать, но потом вступили в переговоры. В то время как страсти всё более накалялись, некто Григорий Валуев подскочил к раненому и застрелил его. После того как цель заговора была достигнута, Шуйскому потребовалось много сил, чтобы остановить своих разошедшихся сторонников. Семь часов кряду в городе шла резня. По одним известиям, поляков было убито 1200 или 1300 человек, а русских — 400, по другим — одних поляков 2135 человек, иные же полагают — 1500 поляков и 2 тысячи русских.