(до июня 1939 г. заказ № 40) После вступления в строй вошла в состав 3-го ДПЛ Первой эскадры ПЛ Шестого флота, и до ноября 1941 г. занимапась боевой подготовкой в водах Метрополии. 27.11.1941 г корабль вышел из Йокосуки, 1.12.1941 г. принял топливо на атолле Кваджелейн и затем, в составе Первой группы ПЛ контр-адмирала Сато Цутому, направился в район к северу от о. Оаху для спасения зкипажей сбитых самолетов, поиска и атаки боевых кораблей противника. 6.12.1941 г. I-21 заняла позицию в назначенном районе патрулирования. 17.12.1941 г. ПЛ (капитан 3 ранга Мацумура) к северу от Гавайских о-вов торпедировала и повредила голландское торговое судно (6418 т), 22-го и 24.12.1941 г. два американских торговых судна (соответствено 6412 т и 8272 т). 12.01.1942 г. корабль возвратился на атолл Кваджелейн и с 15-го по 23.03.1942 г. перешел в Сасебо, где на базе флота за 140-мм орудием смонтировали оборудование для транспортировки карликовой ПЛ типа А[48]. 6.04.1942 г. I-21 направилась к северному побережью Австралии для разведки подходов к портам и базам. 18.04.1942 г. она получила приказ атаковать американские АВ, нанесшие удар по Токио, и направилась к о-вам Бонин. 19.04.1942 г. бортовой ГСМ корабля вел поиск авианосцев противника. 22.04.1942 г. ПЛ получила приказ следовать к о-вам Новая Каледония для борьбы с судоходством противника. 25-го и 29.04.1942 г. I-21 (капитан 3 ранга Мацумура) у о. Новая Каледония потопила два американских торговых судна (соответственно 5210 т и 6611 т). 29.04.1942 г. ПЛ направилась к западным Соломоновым о-вам. 1.05.1942 г. бортовой ГСМ корабля осуществлял поиск судов союзников. 2.05.1942 г. корабль безуспешно атаковал бомбардировщик с АВ Yorktown, от которого I-21 в этот момент находилась в 32 милях. 4.05.1942 г. ГСМ корабля произвел облет северного побережья Австралии, 8.05.1942 г. — порта Дарвин и 16.05.1942 г. — о. Сува (о-ва Фиджи). 20.05.1942 г. ПЛ пришла на атолл Трук. 23.05.1942 г. она в качестве флагмана группы капитана 1 ранга Ханку Сасаки направилась к Сиднею. 31.05.1942 г. ГСМ произвел облет порта Сиднея, где обнаружил боевые корабли. 2.06.1942 г. I-21 (капитан 3 ранга Мацумура) получила приказ следовать к Тасмании, где 4.06.1942 г. потопила американское торговое судно (5527 т). 6.06.1942 г. корабль обстрелял из 140-мм орудия сталелитейный завод и верфи в Ньюкасле. 27.06.1942 г. ПЛ возвратилась на атолл Трук. 28.08.1942 г. она направилась к Соломоновым о-вам для борьбы с судоходством противника. 16.09.1942 г. I-21 включили в состав Соединения "Б", призванного осуществлять поиск и атаку кораблей противника у о-вов Эспириту Санто. 17.09.1942 г. она пришла в Рабаул для пополнения запасов и 22.09.1942 г направилась к о-вам Эспириту Санто. 24.10.1942 г. у о. Санта Круз I-21 (капитан 3 ранга Мацумура) обнаружила американский ЭМ Porter, спасавший пилотов сбитых самолетов с АВ Ноrnеt, и двумя торпедами (из четырех выпущенных) потопила его. 17.11.1942 г. в том же районе лодка потопила американский войсковой ТР (7176 т). 21.11.1942 г. корабль возвратился в Рабаул. 15.12.1942 г. I-21 направилась к восточным Соломоновым о-вам для борьбы с судоходством противника. 1.01.1943 г. ее передали в состав 1-го ДПЛ Восьмой эскадры Шестого флота. 7.01.1943 г. корабль получил приказ следовать к северному побережью Австралии. 19.01.1943 г. ПЛ (капитан 3 ранга Мацумура) на подходах к Сиднею потопила австралийское торговое судно (4920 т), 5-го и 9.02.1943 г. — два американских торговых судна (соответственно 6230 т и 7810 т), 11.02.1943 г. — английское торговое судно (2410 т), 24.02.1943 г. в проливе Торрес — американское торговое судно (6190 т) и 27.02.1943 г. у северного побережья Австралии — австралийское торговое судно (2877 т). 18.03.1943 г. I-21 пришла на атолл Трук. С 20.03 по 2.04.1943 г. она перешла в Куре, где на верфи флота провели текущий ремонт корпуса и механизмов. 13.05.1943 г. ПЛ вошла в состав Специального соединения контр-адмирала Кондо, призванного противодействовать американскому вторжению на Алеутские о-ва. 19.05.1943 г. она пришла на о. Парамушир, где выгрузили ГСМ, часть торпедного и артиллерийского боезапаса. С 6-го по 19.06.1943 г. I-21 доставила на о. Кыска (11.06.1943 г.) 16 т продуктов питания и вывезла 80 чел. 10.07.1943 г. ПЛ пришла в Йокосуку и с 14-го по 29.07.1943 г. перешла на атолл Трук. 4.09.1943 г. она направилась к Новым Гебридам для борьбы с судоходством противника. 11.11.1943 г. I-21 (капитан 3 ранга Инада) потопила американский войсковой ТР (6711 т). 16.11.1943 г. корабль возвратился на атолл Трук. 17.11.1943 г. лодку включили в состав Специального соединения капитана 1 ранга Ивагами, призванного противодействовать американскому вторжению на о-ва Джилберта, и в тот же день она вышла в море. 29.11.1943 г. I-21 к югу от о. Тарава в надводном положении обнаружил и потопил со всем экипажем самолет с американского эскортного АВ Chenango.