ДНК. История генетической революции

После принятого в 1999 году спонтанного решения основать компанию 454 Ротберг рассмотрел несколько стратегий развития и наконец остановился на новой методике под названием пиросеквенирование, ранее разработанной шведскими исследователями. Идея пиросеквенирования заключается в регистрации пирофосфата, который образуется при присоединении очередного нуклеотида ДНК-полимеразой. Детекция пирофосфата осуществляется за счет каскада химических реакций, который заканчивается выделением кванта света. Для реализации метода создается иммобилизованная на твердой фазе клональная библиотека одноцепочечных фрагментов ДНК. Ко всем фрагментам ДНК присоединяется адаптер, с которым будет комплементарно связываться праймер – затравка для синтеза комплементарной цепи ДНК-полимеразой. Далее производится серия последовательных циклов, в процессе которых к закрепленной на твердой фазе ДНК по очереди добавляют дезоксинуклеотидтрифосфаты всех четырех типов: A, T, Г, Ц. Если на секвенируемой цепи ДНК есть комплементарный к добавленному нуклеотиду, то при образовании фосфодиэфирной связи побочным продуктом станет пирофосфат. Он активирует каскад химических реакций: пирофосфат вместе с адено-зинсульфофосфатом (АСФ) при помощи фермента АТФ-сульфурилазы образуют АТФ, который является источником энергии для проведения реакции окисления фермента люциферина (фермент, обеспечивающий биолюминесценцию у светлячков) в оксилюциферин с выделением кванта света. Интенсивность выделяемого света пропорциональна числу включенных в цепь нуклеотидов (чем больше подряд одинаковых нуклеотидов, тем сильнее световой сигнал). Команда Ротберга состояла из талантливых ученых и программистов; один из инженеров даже участвовал в разработке телескопа «Хаббл». Успешная стратегия компании способствовала ее переходу на коммерческие рельсы.

Летом 2005 года компания 454 опубликовала статью (я прочел ее в журнале Nature), в которой был описан не только ее прибор GS20, но и методика секвенирования бактериального генома. В следующем году при помощи секвенатора GS20 учеными было успешно реализовано несколько проектов, упоминания о которых неизменно становились «научным хитом». Так, по кусочкам секвенировали геном неандертальца, идентифицировали вирус, из-за которого таинственно исчезали медоносные пчелы, и (это буквально сюжет для сериала «CSI: Место преступления») обнаружили редкий вирус, из-за которого умер европейский студент, пешком путешествовавший по Австралии. Наступила новая эра секвенирования. Технология крепла, Ротберг решил взяться за секвенирование генома реально живущего человека – и зародился проект «Джим». Хотя до «генома за 1000 долларов» было еще очень далеко, смета проекта «Джим» в один миллион долларов была ничтожно мала по сравнению с сотнями миллионов долларов, потраченных на первое секвенирование генома человека.

Маленький шаг вперед: внутрикорпоративное письмо руководителям Solexa, в котором сообщается о ключевом достижении – отсеквенирован первый геном крошечного вируса ФХ174

К апрелю 2008 года, когда статья об этом исследовании была опубликована в Nature (через 50 лет после публикации статьи о двойной спирали), у Ротберга и компании 454 развеялись всяческие сомнения по поводу поля и места деятельности. На ниве «новаторского секвенирования» становилось людно. В 2005 году талантливый профессор из Стэнфорда Стив Квейк опубликовал статью с описанием нового метода одномолекулярного секвенирования ДНК. Метод был применен для считывания всего пяти оснований, но это настолько впечатлило венчурного капиталиста и предпринимателя Стэна Лапидуса, что он немедленно полетел в Калифорнию, чтобы уговорить Квейка на открытие новой биотехнологической компании. Helicos сконструировала секвенатор, который позволил наблюдать на уровне единичной молекулы за синтезом комплементарной цепи одной молекулы одноцепочечной ДНК с помощью одной молекулы ДНК-полимеразы. В этой технологии флуоресцентно меченные нуклеотиды и конфокальная микроскопия высокого разрешения позволяют секвенировать последовательность в реальном времени и одновременно для многих полимераз. Лапидус окрестил его «генным микроскопом». С помощью этого микроскопа Квейк собирался секвенировать собственный геном за каких-нибудь 50 тысяч долларов. Увы, компания Helicos столкнулась с технологическими сложностями и разорилась, но ее технологиями по-прежнему пользуются некоторые весьма солидные фирмы.