Во дворе замка Эскуриал. Дон Карлос ждёт своего близкого друга – маркиза Родриго ди Позу. Появляется ди Поза. Он только что вернулся из Фландрии и теперь рассказывает Карлосу о страданиях народа, находящегося под игом Испании. Ведь Дон Карлос является одним из организаторов заговора против короля Филиппа II во Фландрии. Но Дон Карлос почти не слушает друга. То, что совсем недавно так его волновало, теперь совершенно его не интересует. Сейчас все его мысли заняты королевой Елизаветой, его бывшей невестой, женой его отца, короля Филиппа II. Наконец, Дон Карлос открывает Родриго тайну своей любви к королеве. Ди Поза понимает, что эта любовь может принести другу несчастье, поэтому он старается убедить Карлоса побороть своё чувство к Елизавете. Народ Фландрии стонет под игом Испании, и сейчас нужно отдать все силы борьбе за свободу Фландрии.
Раздаются удары колокола. Из монастыря Сан-Джусто выходит процессия. Впереди идут король и королева. Королева видит Карлоса. Взволнованная этой встречей, Елизавета быстро уходит. Её сопровождают придворные дамы. Дон Карлос обращается к ди Позе с просьбой помочь ему.
Дворец королевы. В ожидании королевы придворные дамы развлекаются. Появляется печальная Елизавета. Принцесса Эболи хочет узнать тайну этой печали. Она внимательно следит за королевой. Родриго ди Поза передаёт королеве послание от её матери – королевы Франции и вместе с ним записку от Карлоса. Родриго просит королеву поддержать Карлоса, оказать ему внимание. Сначала Елизавета колеблется, но потом, наконец, решается на встречу, о которой её просит Дон Карлос. Принцесса Эболи слышит отдельные слова из беседы королевы и маркиза, она понимает, что разговор идёт о любовных страданиях Карлоса. Она уверена, что причина печали Карлоса – его тайная любовь к ней. Она решает сама назначить свидание Карлосу.
В одной из комнат дворца встречаются Елизавета и Дон Карлос. Дон Карлос просит Елизавету убедить отца в том, что ему, Карлосу, необходимо покинуть Испанию и получить в своё владение Фландрию. Елизавета призывает наследника Филиппа II к терпению, ласково называет его сыном. Дон Карлос уже не может сдержать своих чувств, он падает к ногам королевы и молит её о любви. Но Елизавета говорит о долге королевы. В отчаянии Дон Карлос убегает.
Узнав, что Дон Карлос встречался с королевой, Филипп отправляет в изгнание маркизу Д’Аранбер, ближайшую подругу королевы, которая, вопреки его приказу, оставила королеву наедине с Карлосом. Он приказывает маркизе до рассвета покинуть страну. Елизавета нежно прощается со своей подругой и уходит вместе с ней, чтобы проводить её в изгнание. Филипп останавливает Родриго ди Позу. Маркиз смело говорит королю о положении во Фландрии. Он требует прекратить казни и разорение народа. Филиппу нравится смелый и честный ди Поза. И король рассказывает ему о своих подозрениях. Но ди Поза думает только о том, чтобы помочь Карлосу и Елизавете осуществить планы освобождения Фландрии.
2. В саду королевы. Сюда на свидание с королевой приходит счастливый Дон Карлос. Он ещё не знает, что записка, которую он получил, была написана принцессой Эболи. Лунная ночь. Появляется женская фигура. Дон Карлос думает, что это королева, бросается к ней и горячо говорит ей о своей любви. И вдруг он видит, что перед ним принцесса Эболи. Дон Карлос понимает, что тайна его любви раскрыта. Он в отчаянии. А Эболи грозит отомстить королеве и Карлосу. Появляется Родриго ди Поза. Он слышит, как Эболи клянётся отомстить Карлосу и королеве, и собирается убить её, чтобы спасти своего друга. Но Дон Карлос удерживает ди Позу, и Эболи скрывается. Родриго просит Карлоса передать ему секретные бумаги о заговоре, который готовится во Фландрии. Дон Карлос сначала отказывается, потому что знает, что его друг стал любимцем короля. Но Родриго так горячо просит, что Дон Карлос, наконец, отдаёт ди Позе тайные списки заговорщиков и план восстания.
3. На площади перед собором толпа народа. придворные идут сюда как на праздник. Сегодня здесь состоится казнь