Важное место в рудольфинской культуре занимает творчество художников-натуралистов, главной темой которых была тщательная и реалистически точная передача явлений природы, будь то растение, минерал или рог нарвала. Увлечение самого императора природными феноменами, необходимость систематизировать наблюдения и собранные в кунсткамере образцы флоры и фауны в их наиболее диковинных проявлениях вызывали к жизни особый вид творчества, где интересы ученого-натуралиста гармонично сочетались с эстетической задачей. Одним из первых и наиболее ярких представителей этого специфического направления рудольфинского искусства является Йорис Хофнагель. Творчество этих художников нацелено на сложное «иероглифическое» содержание, на мир причудливых сопоставлений. Хофнагелю приходилось создавать работы, в которых, подобно фантастическому иллюзионизму Арчимбольдо, из вполне точных, натуралистических деталей — образов живой природы — возникало отвлеченное, «коллажное» целое. Хофнагель был самоучкой родом из Мехелена. Он вырос в самой сердцевине местной художественной традиции. Незаурядное мастерство художника-миниатюриста создавать из сухих иллюстраций к научному трактату оригинальное явление проявилось в творчестве Йориса Хофнагеля (Старшего) и было продолжено его сыном Якубом. Для Фердинанда II Тирольского художник сделал миссал (богослужебную книгу, которая содержала тексты для совершения мессы) с миниатюрами на полях. В 1594 году для императора Максимилиана II он иллюстрировал книгу с образцами шрифтов, а в 1596 году закончил вторую книгу шрифтов, уже для Рудольфа II. Тончайшая каллиграфия соединяется здесь с миниатюрами, гротесками. Самый известный труд Хофнагеля, за который он получил не только титул «натуралиста», но и «иероглифика» — четыре книги, посвященные изображению животного мира, под названием «Четыре элемента» (земля, вода, воздух, огонь). Изображения заселяющих земной шар существ — от тигра до морской раковины — лучшее достижение художника. Тщательным образом воспроизведенные бабочки, жуки, ящерицы скомпонованы в красивые законченные композиции, мастерски расположенные на листе пергамента. Один из истоков его творчества — поздняя нидерландская миниатюра с ее традицией и вкусом к изображению реальности. Культура миниатюрного письма, использование плоскости, организация красочных пятен и линейного рисунка в изысканное орнаментальное целое, в котором, однако, не теряется натурная точность изображения, свойственны ему в высшей мере. Изображения живых существ помещены на чистой поверхности листа, без всякого пейзажа, вне всякой среды и связаны между собой лишь прихотью художника, игрой орнаментальных линий и принадлежностью к той или иной стихии. Известно, что в 1590-х годах, в самом конце творчества, Хофнагель Старший исполнял и отдельные натюрморты, обычно из цветов, в привычной для него технике акварели на пергаменте.
Йорис Хофнагел находился на службе у императора Рудольфа II около 10 лет, начиная с 1591 года. Он был также непревзойденным мастером по изготовлению эмблем, карт и городских ведут (документально точные архитектурные пейзажи).
В выборе немецких художников император проявил высокую художественную культуру. При его дворе работали два лучших мастера Германии позднего возрождения: Хайнц и фон Аахен, и, кроме того, ряд менее знаменитых художников: Маттиас Гунделах, Ганс Гофман, Иеремиас Гюнтер и чехи Симон Гуцкий и Даниил Алексиус, не считая плеяды миниатюристов, специальностью которых было изготовление роскошно разукрашенных богослужебных книг.
Из многочисленных художников-рудольфинцев особо выделяются Спрангер, фон Аахен и Хайнц — крупнейшие маньеристы Европы. Старшим и самым выдающимся из королевских художников был Бартоломеус Спрангер, голландец, обучавшийся искусству в Италии. Его рекомендовали Максимилиану в 1575 году, и с той поры он служил германской короне, выполнив для Максимилиана, а затем и для Рудольфа, множество декоративных работ на стенах дворца. Рудольф за честную службу наградил Спрангера титулом «ван ден Шильден». Его самые известные картины: «Аллегория добродетелей Рудольфа» (в настоящее время находится в галерее Вены), «Марс с Венерой и купидоном» (также в Вене), «Диана и нимфы» (в Стокгольме), «Венера в окружении граций» (в Санкт-Петербурге), «Купидон и Психея» (в Штутгарте), а также множество портретов членов императорских семей.
Иоганн фон Аахен родился в Кельне, в молодые годы отправился в Италию и стал учеником Микеланджело и Тинторетто, а по возвращении поступил на службу к Рудольфу и занял при особе императора место его главного арбитра в вопросах художественных приобретений. Он прославился в основном портретами и историческими сценами, а также жанровыми и мифологическими картинами. Его холст под названием «Истина торжествует под сенью Справедливости» в настоящее время находится в Вене.