Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

Как правило, проблемой в разделении энантиомеров является невысокая селективность и, вследствие этого, длительные времена анализов, даже в случае, когда найдем подходящий хиральный селектор для разделения. Причиной этого являются небольшие различия в подвижностях D- и L-форм анализируемых веществ, а также наличие сильного ЭОП, который перекрывает эффект разделения в немодифицированных капиллярах. Небольшие различия в подвижностях приводят к разделению только в тех случаях, когда эффективные участки движения максимальны. Это означает, что анализируемое вещество в электрическом поле должно двигаться от точки ввода до детектора самостоятельно. Наличие ЭОП в данном случае мешает разрешению. Для достижения максимального разрешения по возможности за короткое время покрытые (модифицированные) капилляры используются при сильно заторможенном ЭОП. При этом можно использовать очень короткие капилляры (7-20 см) и сильные электрические поля (до 1000 В/см). При использовании подходящего хирального селектора это приводит к очень малым временам анализа при высоком разрешении. Различие между немодифицированным и покрытым капилляром продемонстрировано на рис. 84.

Рис. 84.Разделение энантиомеров гексабарбитала в капилляре с покрытием (А) и без покрытия (В).

_{Условия разделения: 0.1 М ТЕЕ, pH 8.3, детектирование при 214 нм; ввод пробы: 1 с, 2 кВ, об. 1.56%р-ЦД, t=25 °C. А) Покрытие капилляра: 4 % линейный полиакриламид, Е=710 В/см (выход заземлен), L-7/27 см. В) Капилляр без покрытия, Е=400В/см. Ь=50/57 см.}

Заметно более высокая эффективность для непокрытого капилляра основана на том, что ЭОП перекрывает подвижность анализируемых веществ, и они очень быстро проходят через детектор. Здесь ясно видно, что более высокая производительность за более короткое время при разделении достигается при применении покрытого капилляра. Использование покрытого капилляра в выборе подходящего хирального селектора играет большую роль, так как в данном случае можно много быстрее определить применимость данного селектора, т. е. его селективность.

11.4. Выбор подходящего LLQ

При использовании ЦД в качестве хиральных селекторов решающее влияние на селективность оказывает не только тип ЦД, но и тип заместителя в производных ЦД. Растворимость ЦД в воде также может резко увеличиться при применении производных. Это показано для тестовой смеси различных типов ЦД и их производных на рис. 85.

Рис. 85.Разделительный потенциал различных типов ЦД.

_{Условия разделения: L=50/57 см, Е= 350 В/см, буфер: 0.1 М ТВЕ, pH 8.3; детектирование при 214 нм, об. 1.5 % ЦД; пробы: 1 — d,1-гексабарбитал, 2 — (!1-дансил-фенидаланин;}

А) α-ЦД, В) гидроксилропил — α-ЦД, С) метил — β-ЦД, D) гидроксипропил-Р-ЦД.

11.5. Оптимизация концентрации ЦД

Следующая важная составная часть оптимизации состоит в установлении подходящей концентрации ЦД. В зависимости от типа анализируемых веществ с ростом концентрации ЦД могут наблюдаться улучшение разрешения, потеря или даже инверсия разрешения. Это может приводить к неправильным выводам о различных механизмах разделения энантиомеров с помощью ЦД. На рис. 86 показано влияние концентрации ЦД на разделение энантиомеров.

Рис. 86.Влияние концентрации гидроксипропил — р-ЦЦ на разрешение пиков при разделении производных дигидропиридина.

_{Условия разделения: L=50/57 см, Е=350 В/см; буфер: 0.1 М Т BE, pH 8.3, различные концентрации ЦД, детектирование при 214 нм.}

В немодифицированной с помощью ЦД буферной системе отрицательно заряженные энантиомеры обладают высокой подвижностью относительно ЭОП, так как они без сопротивления могут проходить сквозь буфер (нижняя электрофореграмма).. Уже небольшие добавки хирального селектора вызывают сильное уменьшение подвижности анализируемых веществ, причем в этом случае наблюдается вполне Достаточная селективность. Разделение при очень низких концентрациях ЦД объясняется различным временем пребывания D- и L-форм в ЦД. Энантиомер с большим временем пребывания в ЦД проявляет меньшую подвижность и детектируется ближе к ЭОП.