При средних значениях pH анализируемые вещества обладают достаточно высокой собственной подвижностью, так что в этом случае различие в подвижности между D- и L-формами может привести к переносу. Анализируемые вещества в данном случае должны пройти достаточно большой эффективный участок пути в капилляре. Потеря разрешения при высоких значениях pH часто объясняется тем, что очень высокий ЭОП не дает достаточно времени анализируемым веществам для разделения в капилляре. Высокий ЭОП приводит к слишком коротким временам пребывания анализируемых веществ в капилляре. При очень высоких значениях pH ЦД сами могут депротонироватъся, из-за чего селективность снова изменяется. Если ЦД имеет одинаковый заряд с анализируемыми веществами, из-за электростатического отталкивания хиральные отличительные черты теряются.
11.7. Оптимизация фоновых электролитов
После выбора подходящего хирального селектора и оптимального значения pH следует оптимизировать также ионный состав разделяющего буфера. Как показано на рис. 90, подвижность буферных ионов влияет на форму пика и разрешение анализируемых веществ.
Рис. 90.
Условия разделения: 1=20/27 см, покрытие полиакриламидное, Е=370 В/см (выход заземлен), об. 0.3 % гидроксипропил-р-ЦД, детектирование при 214 нм, пробы: дансил-фенилаланин (1), производное дигидропиридина (2). А) 10 мМ лимонная кислота, pH 6.0. В) 25 мМ MES/Tpuc, pH 6.0. С) 20 мМ фосфатный буфер, pH 6.0.
Во всех трех случаях выдерживались одинаковые условия ввода пробы, и все условия разделения, за исключением буферных ионов, поддерживались одинаковыми. Ясно видно, что в случае применения в качестве буфера лимонной кислоты получается лучшее разрешение и, как следствие, более высокая эффективность разделения. Это приводит также к большей чувствительности системы. Этот пример показывает, что и при низких значениях а путем улучшения эффективности можно достичь достаточного хорошего разрешения анализируемых веществ.
11.8. Буферные добавки
Наряду с уже описанными параметрами определяющее влияние на разделительную способность хирального селектора могут оказывать многие добавки к разделяющему буферу. Однако заранее невозможно предсказать, может ли добавка таких компонентов, как органические растворители, комплексообразующие средства, детергенты и т. д., привести к улучшению или исчезновению разделения.
В некоторых публикациях предпринята попытка представить модель такого поведения. В нижеописанном уравнении приведены основные факторы, влияющие на различия подвижностей.
Здесь
[
Разность подвижностей и, соответственно, селективность зависят в основном от концентрации ЦД, констант равновесия между анализируемыми веществами и хиральным селектором и разности подвижностей в комплексном и некомплексном состояниях анализируемых веществ. Из вышесказанного следует, что при постоянной концентрации ЦД добавка органического компонента к буферу может изменить константу равновесия в положительную (улучшение разрешения) или отрицательную (потеря разрешения) сторону. Характер изменения зависит в основном от концентрации
На рис. 91 представлено влияние мочевины, метанола и ДДСН на время миграции, проявление пика и разрешение. Для буферного раствора, насыщенного (3-ЦД (об. 1.56 %), в данном примере наблюдается наиболее быстрое время миграции (А).
Рис. 91.
Условия разделения: L 40/47 см, Е=232 В/см, (анод на стороне детектора), капилляр с покрытием (4 % линейный полиакриламид), детектирование при 214 нм; буфер: 0,1 М ТВЕ, pH 8.3, добавки-.А) об. 1.56 % р-ЦД. В) об. 12 % р-ЦД, 7 М мочевина, 0.1 % ДДСН. С) об. 12 % р-ЦД, 7 М мочевина, 10 % метанол, 0.1 М ДДСН,D) об. 12 % р-ЦД, 7 М мочевина. Е) об. 12 % р-ЦД, 7 М мочевина, 10 %) метанол.