Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

В некоторых случаях покрытия стенок капилляра, например, виниловыми группировками, гель при полимеризации в капилляре может сшиваться с нанесенным поверхностным слоем. Этот способ дает высокую целостность покрытия капилляра и, как следствие, приводит к очень высокой эффективности. Используя этот метод с применением поперечносшитых и связанных со стенкой капилляра ковалентными силами гелей, удалось получить наивысшие эффективности в КЭ (30 млн. теоретических тарелок на метр).

Селективность гелей можно изменять с помощью выбора отношения концентрации наносимого мономера (%Т) к концентрации сшивающего агента (% С).

Свойства поперечносшитых гелей на полиамидной основе приведены в таблице 28.

Однако, перечисленные гели имеют некоторые недостатки:

— во время хранения капилляров, заполненных такими гелями (в отсутствие смачивания концов капилляра буфером) гель на концах капилляра может высохнуть, и, таким образом, капилляр становится непригодным для дальнейшей работы,

— обмен в среде буфера в капилляре невозможен или требует длительного времени,

— термостабильность такого рода гелей недостаточна. Растворенные газообразные компоненты буфера при высоких температурах образуют пузыри в капилляре. Похожий эффект наблюдается также в сильных полях (>500 В/см). Образование воздушных пузырей в капилляре, заполненном гелем, всегда приводит к локальным нарушениям геля и непригодности капилляра,

— поскольку для разделения применяют всегда один и тот же гель, неизбежны явления старения, вызванные "обескровливанием" геля. По сравнению с этим в классическом гелевом электрофорезе применяют всегда только одну зарядку гелем на один анализ, что может устранить этот эффект,

— изготовление самодельных капилляров (как было принято) требовало многих "ноу-хау" при модифицировании поверхности и, особенно, при проведении полимеризации в капилляре.

Эти проблемы стали причиной того, что попытки промышленного выпуска таких капилляров потерпели неудачу. На рис. 94 в качестве примера показана огромная производительность при разделении олигонуклеотидов таким поперечносшитым полиакриламидным гелем.

Рис. 94.Разделение поли(уридин-5'фосфата).

_{Условия разделения: L=45, Е=300 В/см, буфер: 0.1 М Тряс, «0.25 М борная кислота, 7М мочевина, 6 % Т, 5"/о С, полиакриламид, детектирование при 260 нм.}

12.1.2. Линейные полиакриамидные гели.

Вышеописанные проблемы в основном преодолеваются при применении в капиллярах несшитых гелей. Свойства этих гелей при их использовании в капиллярах сильно зависят от концентрации мономера. В таблице 29 приведены свойства и основные области применения несшитых полиакриламидных гелей.

При низких концентрациях мономера акриламида уже нельзя говорить о геле в обычном смысле этого слова, поскольку до концентрации примерно 4 % Т имеет место только жидкий, хорошо текучий высокомолекулярный раствор полимера. Эти полимерные растворы можно назвать также "жидкими гелями", "полимерными матрицами" или "буфером с ситовыми свойствами". Такие растворы можно вводить в капилляр под давлением, под которым они находятся в сосуде с буфером. Это делает возможной легкую замену "жидких гелей" в капилляре после каждого анализа. Тем самым, перед каждым разделением будет иметься в распоряжении свежая, ненапряженная разделительная матрица, что отражается положительно на стабильности метода и результатах анализа. Таким образом, в данном случае образование пузырей и высыхание капилляра исключаются. Это показано на рис. 95, где приведены данные после 400 анализов, показывающие, что капилляр все еще работоспособен.

Для достижения высокой эффективности и селективности и в этом случае следует останавливать ЭОП. Любой поток внутри капилляра уменьшает эффективность разделения. Следует также упомянуть, что в случае применения этих гелей возможна также работа с капиллярами без покрытия. В общем случае разрешение будет хуже, причем разделение начинается при достаточно высоких ММ. В покрытых капиллярах разделяются вещества с достаточно длинными цепочками.

Рис. 95.Тест на стабильность капилляра, покрытого линейным полиакриламидом (ЛПА).

_{Условия разделения: L=30/37 см, Е=300 В/см, температура 30 °C, 3 % Т, 0 % С, ЛПА, 0.1 М ТВЕ, pH 8.3. Проба: Phi X 174 RFHHK Нае III; А — 1-ый, В — 144-ый, С — 344-ый, D — 420-ый опыты.}

На рис. 96 показано разделение остаточных фрагментов в капилляре, покрытом линейным гелем (3 % Т, 0 % С).

Рис. 96.Разделение остаточных фрагментов ДНК в капилляре, покрытом ЛПА.