Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

Рис. 98.Разделение белков большой ММ в поперечносшитом полиакриламидным геле.

_{Условия разделения: L=20 см (эффективная), Е=180 В/см, буфер: 0.12 М Трис, 0.12 М гистидин, pH 8.8, 0.1 МДЦСН, 1 % 2-пропанол, 5 % Т, 1 % С, полиакриламид. Проба: 1 — овальбумин, 2 — альбумин крупного рогатого скота, 3 — бета-галактозидаза, 4 — миозин.}

Таким образом, полиакриламидный гелевый электрофорез с ДДСН представляет собой метод, альтернативный методу ИЭФ и применяется также в классическом 20-электрофорезе (ИЭФ, совмещенный с ДДСН-ПААГ-электрофорезом) в качестве высокоразрешающего способа разделения.

12.2. Гели на основе пописахаридов и других полимеров

В КГЭ в качестве разделяющей среды наряду с полиакриламидными гелями применяют ряд других водорастворимых полимеров. В таблице 30 приведены используемые до настоящего времени полимеры и основные области их применения.

Основным преимуществом этих разделительных матриц является их УФ-проницаемость в области длин волн ниже 260 нм. Низкая токсичность этих полимеров по сравнению с мономером акриламидом упрощает работу с этими растворами и их хранение. К тому же эти полимеры при применяемых концентрациях менее вязки, так что может проводиться их замена после каждого анализа. Однако, для некоторых длин ДНК они дают меньшую разрешающую способность, чем акриламидные гели. Эти гели очень выгодно применять для разделения ДДСН-белковых комплексов, т. к. в данном случае их можно детектировать с большой чувствительностью при относительно коротких длинах волн (214 нм). В этом случае следует дополнительно оптимизировать выбор некоторых буферных сред, не поглощающих в УФ-области На рис. 99 представлено разделение стандартного ДДСН-белкового комплекса в растворе декстрана, прозрачном по отношению к УФ-лучам. Три разделения показывают воспроизводимость при замене полимерных растворов в капилляре.

Рис. 99.Разделение ДДСН-белковых комплексов и стабильность капилляра при замене декстранового полимерного раствора.

_{Условия разделения: L=30 см (эффективная), Е=300 В/см, буфер: 0.06 М 2-амино-2метил=1-3-пропандиод/какодидовая кислота, pH 8.8, 0.1 % ДДСН, об. 10 %) декстраи (ММ 2000000), детектирование: 214 им.}

Различия между этими полимерными матрицами заключаются в основном в пористой структуре. Размеры пор и упругость встроенных в гель полимерных цепочек оказывают значительное влияние на работоспособность при разделении по молекулярным размерам. На рис. 100 представлена структура агарозного геля и ее формирование из мономерных волокон (слева). Гидроксиэтилагароза (рис. 100, справа) обладает сильно измененной структурой. Образование сдвоенной структуры приводит к сужению пор, и такой гель лучше применять для биополимеров с меньшими размерами.

Рис. 100.Формирование агарозного геля и образование сдвоенной структуры. Слева — регулярная агароза, справа — гидрокси-этилагароза.

12.3. Модели миграции биополимеров в полимерных растворах

Поскольку подвижности молекул ДНК различных размеров в свободных растворах из-за одинаковых соотношений поверхность/заряд не различаются, разделение по молекулярным размерам может не достигаться. Это делает необходимым применять среду с ситовыми свойствами. Ситовые свойства в простейшем смысле описываются взаимодействиями молекул анализируемых веществ с волокнами разделяющего полимера (геля).

В зависимости от размеров пор и длин биополимеров между полимерными волокнами имеют место различные конформации анализируемых веществ. Эти конформации отвечают за различные подвижности и возникающие нерегулярности.

Ясно, что молекулы в компактной или разреженной конформациях обладают подвижностью, отличной, например, от подвижности молекул вытянутой формы. Конформации можно наблюдать с помощью лазерной флуоресцентной микроскопии.