Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

Для различных взаимодействий молекул ДНК обсуждаются различные механизмы разделения. Сила взаимодействия с полимерной матрицей больше для больших молекул ДНК, на этом и основано разделение по молекулярным размерам. В зависимости от конформации и размеров молекул анализируемых веществ (биополимеров), а также от пористой структуры полимерного раствора (геля) можно придти к различным механизмам разделения. Как правило, для подвижности анализируемых веществ в разделяющем полимере находят зависимость от размеров молекул анализируемых веществ. Такая зависимость показана на рис. 101.

Рис. 101. Зависимость логарифма подвижности анализируемых веществ от логарифма длины сегментов этих веществ при постоянном размере пор разделяющей матрицы.

Здесь можно выделить 4 области:

A) В начальной области кривой подвижность изменяется слабо с ростом длины анализируемых веществ, т. е. для маленьких фрагментов селективность невысока. В этой области, называемой областью Огстона, размеры пор геля больше, чем размеры самих молекул, которые без заметного сопротивления проходят через гель. При этом молекулы могут сохранять свою глобулярную структуру. Это является причиной низкой селективности в данной области размеров молекул анализируемых веществ.

B) В так называемой области рептации имеет место большое изменение подвижности анализируемых веществ с ростом длины их цепочек и, тем самым, высокая селективность. В этой области молекулы анализируемых веществ больше, чем поры геля, так что молекула может проникнуть в поры только в вытянутом состоянии, огибая в "змеевидном" движении волокна гелевой матрицы (рептация). Таким образом, могут возникнуть сильные взаимодействия анализируемых веществ с матрицей геля, что приводит к появлению максимума селективности.

C) При средних длинах цепочек анализируемых веществ достигается минимум подвижности. Это объясняется тем, что оба конца молекулы движутся в одном направлении и сильно переплетаются с волокнами разделяющего полимера (ловушка). Это приводит впоследствии к уже независящей от размеров молекул подвижности (аномальная миграция и даже инверсия). Однако это переплетение для маленьких молекул не играет существенной роли, т. к. они могут быстро освободиться от такой конформации. Для больших молекул вероятность выхода из такого состояния очень мала.

D) В последней области при очень больших длинах молекул различия анализируемых веществ относительно их размеров становятся все меньше, что приводит в дальнейшем к отсутствию различий в подвижностях.

Как видно из рис. 102, экспериментально полученные зависимости согласуются с теорией.

Рис. 102. Зависимость между подвижностями смеси остаточных фрагментов ДНК и числом основных пар в логарифмическом масштабе.

_{Условия разделения: L=40/47 см, буфер: 0.1 М ТВЕ, pH 8.3, 3 % Т, 0 % С, ЛПА, различные температуры и силы поля (указаны на рисунке).}

Однако, было обнаружено, что сильное влияние на правильную последовательность миграции (маленькие молекулы перед большими) и подвижность анализируемых веществ оказывают также температура, сила поля и концентрация геля. В экстремальных случаях может наблюдаться инверсия последовательности миграции, т. е. более длинные фрагменты ДНК движутся сквозь разделяющий гель быстрее, чем меньшие фрагменты ДНК. Это нежелательное явление можно в общем случае устранить следующими способами:

— уменьшением напряжения налагаемого поля,

— повышением температуры в системе,

— уменьшением концентрации геля,

— буферными добавками.

Качественно нелинейность подвижности можно описать также моделью рептации:

Здесь μ — подвижность биополимера, Q — общий заряд молекулы, f — коэффициент трения между волокнами геля и полимером, N — число сегментов биополимера (число основных пар), q — заряд на величину N, Е — сила поля, а — длина поры геля, Т — температура и Кь — константа Больцмана. Из этого уравнения видно, что подвижность обратно пропорциональна длине цепочки только в том случае, когда второй член пренебрежимо мал. Это бывает только при работе с относительно слабыми полями (<200 В/см). Согласно этому соотношению следует работать при повышенных температурах, что также подтверждается на практике.

В зависимости от размеров пор геля и длины биополимера наблюдается различная конформация анализируемых веществ между волокнами полимера. Эти конформации в конце концов ответственны за различную подвижность и наблюдаемые нерегулярности. Ясно, что компактная или напряженная конформация вызовет подвижность, отличающуюся, например, от подвижности для вытянутой формы.

Конформации, показанные на рис. 103, можно наблюдать методом лазерной флуоресцентной микроскопии.