Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

_{Условия разделения: L=40/47 cm, Е=150 В/см, I=50 °C. Буфер: 0.1 М ТВЕ, pH 8.3, 3 % Т, 0 % С ЛПА, пробы: pBR 322 MSP I, pBR 322 Hae III, детектирование: 254 нм.}

Поскольку все фрагменты присутствуют в эквимолярных соотношениях, но большие фрагменты обладают большим числом адсорбционных центров, с ростом длины цепочек растет и площадь пиков. По этой причине маленькие фрагменты дают маленькие пики и, вследствие малого сопротивления миграции в геле, на фореграммах проявляются в первую очередь. Нумерация фрагментов ДНК в данном случае проводилась в предположении роста молекулярных размеров. Число ступеней разделения здесь равно примерно 600 тысячам теоретических тарелок на метр. При таких высоких числах ступеней разделения капилляры желательно располагать в горизонтальном положении, поскольку поворот капилляра может привести к потере эффективности. Эти потери эффективности, зависящие от расположения капилляра, наблюдаются в КЭ при очень высоких эффективностях (> 1 млн. теоретических тарелок).

Большое влияние на селективность и эффективность оказывает также температура. Вообще эффективность падает с ростом температуры, однако для фрагментов некоторых размеров может достигаться лучшее разрешение, что обусловлено улучшающейся селективностью. Влияние температуры, напряженности поля, пористой структуры геля и буферных добавок на селективность и последовательность миграции анализируемых веществ будет рассматриваться в дальнейшем при обсуждении моделей миграции.

В случае более высоких концентраций мономера растворы полимера становятся высоковязкими, поэтому начиная с концентрации 8 % их следует полимеризовать в капилляре. Селективность этих высокомолекулярных линейных гелей (например 12 % Т) схожа с селективностью поперечносшитых гелей, которые всегда следует полимеризовать в капиллярах. Поскольку, однако, в таких гелях не образуются ковалентные связи цепочек между собой, а также со стенками капилляров, сильное напряжение геля не приводит к разрушению его структуры. Эта незафиксированность цепочек в геле придает полимеру большую гибкость и, вследствие этого, повышает его продолжительность жизни. На рис. 97 представлено разделение олигонуклеотидного стандарта в покрытом капилляре, заполненном 12 % Т ЛПА.

Рис. 97.Разделение смеси полидеоксиаденозииа (pd (А) 40–60) с олигонуклеотидами в капилляре, заполненном гелем 12 % Т, 0 % С.

_{Условия разделения: L=30/37 см, Е=300 В/см; буфер: 0.1 М ТВЕ, 7 М мочевина, pH 8.3.}

Эти гели находят применение также в определении последовательности нуклеотидов в ДНК, причем для детектирования в данном случае применяют лазерноиндуцируемую флуоресценцию. Гели непроницаемы для УФ-лучей с длиной волны меньше 250 нм. Кроме того, поскольку в распоряжении имеются очень малые пробы, в данном случае требуется очень высокая чувствительность детектора. Граница определения в данном случае составляет примерно 10^-11 М.

12.1.3. Полиакриламидный гелевый электрофорез белков с ДДСН

КГЭ применялся почти исключительно для разделения молекул ДНК, поскольку чувствительное определение белков в гельзаполненных капиллярах невозможно из-за поглощения самого полиакриламида в области относительно коротких УФ-лучей (<250 нм). Взаимодействия белков с гелями также могут играть определенную роль, так что до настоящего времени в гельзаполненных капиллярах описано только успешное разделение белков, денатурированных ДДСН.

Обычно белки соответственно своим значениям р1 обладают различным зарядом молекул, на этом основано их разделение при применении нормальных буферных систем в условиях, исключающих денатурацию. Для достижения разделения по ММ белки должны обладать одинаковым отношением заряда к поверхности. В этом случае возможно разделение в геле по молекулярным размерам или ММ.

Белки полностью денатурируются в избытке ДДСН и 2-меркаптоэтанола (разрушение бисульфидных мостиков). Возникающие цепочки полипептидов связывают независимо от своих размеров и структуры постоянное количество ДДСН (1,4 г ДДСН/1 г белка). Поскольку ДДСН гасит заряды белково-детергентных комплексов, все белки, обработанные таким способом, будут иметь одинаковые соотношения зарядов на единицу массы. Из этого следует, что подвижность в буферной среде без "ситовых свойств" будет однородна. Если использовать теперь гель, то измеряемая подвижность анализируемых веществ будет пропорциональна эффективным ионным радиусам и, следовательно, ММ этих веществ (цепочек полипептидов). Из линейной зависимости между логарифмом ММ и временем миграции можно определить ММ белка. На рис. 98 показано разделение ДДСН белкового стандарта с высокой ММ.