Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

Рис. 103.Зависимость подвижности биоподимеров от их конформации в разделяющем геле (см. также рис. 100).

Вышеупомянутые модели миграции описывают и объясняют все наблюдаемые картины и аномалии. С помощью этих моделей можно также объяснить причины нелинейности между последовательностью миграции и размерами молекул и устранить их.

13. Изоэлектрическая фокусировка (ИЭФ) в капиллярах

В классической форме электрофореза ИЭФ представляет собой разработанный способ разделения с высокой эффективностью. В основном он применяется для цвиттерионов и амфотерных проб, таких как белки и пептиды, которые различаются не по своей подвижности, а по изоэлектрическим точкам (значениям pi). Изоэлектрическая точка представляет собой специфическую величину для амфотерных веществ и показывает, при каком значении pH это вещество перестает двигаться в электрическом поле и внешне выглядит как электрически нейтральное. Таким образом, ИЭФ можно применять также для определения изоэлектрической точки белков и других амфотерных веществ.

Сначала необходимо вдоль участка разделения с помощью цвиттерионных соединений, так называемых амфолитов, создать градиент значений pH. В качестве амфолитов применяют смесь различных полиамино-поликарбокси-кислот, различающихся по своим значениям Pi.

Под влиянием сильной кислоты в анодном и сильной щелочи в катодном пространствах эти амфолиты при наложении напряжения располагаются согласно своим значениям р! вдоль участка разделения и, тем самым, создают градиент pH (см. рис. 104).

Рис. 104.Принцип ИЭФ.

_{а) наложение градиента pH; Ь) ввод пробы; с) установление равновесия (устойчивое состояние); d) зависимость силы поля (сплошная линия) и значения pH (штрихи) от расстояния на участке разделения.}

Этот градиент в случае классического электрофореза на плоской подложке стабилизируется с помощью геля для удаления конвекционных потоков. Белки движутся под действием градиента pH до тех пор, пока сохраняют заряд. При значении pH, соответствующем их изоэлектрической точке, электрофоретическая миграций заканчивается. Высокая эффективность ИЭФ основывается на фокусирующем свойстве градиента pH, который практически не допускает уширемия полос, вызванного диффузией. Амфолиты можно или добавлять к буферу, или ковалем-то связывать с гелем (иммобилизованный градиент pH (ИГП)). Этот вариант ИЭФ вследствие очень крутого градиента pH ведет к очень высокой разделительной способности. Чем меньше различия в значениях р! пробы, тем более резкие градиенты pH необходимо накладывать для того, чтобы обеспечить разделение этих проб.

При переносе ИЭФ на узкие капилляры применение стабилизирующих гелей не является безусловно необходимым. Правда, ЭОП необходимо полностью подавить для того, чтобы сделать возможным образование градиента pH, иначе ЭОП быстро вынесет раствор амфолита из капилляра и сделает невозможным проведение фокусировки. Управлять ЭОП можно, как уже отмечалось в одной из глав, модифицируя поверхность капилляра. Понижать ЭОП для проведения фокусировки можно также, добавляя высоковязкие полимеры, например, метилцеллюлозу, для повышения вязкости буферного раствора. Преимущество последнего способа заключается в том, что зачастую для ИЭФ необходимо применять очень высокие значения pH, а ковалентное покрытие капилляра не может долго выдерживать сильнощелочные значения pH.

В отличие от ИЭФ на плоской подложке в капилляре образование градиента pH и фокусировка белков протекают в одну стадию. Капилляр заполняют раствором амфолита, уже содержащим пробы, и катодный конец капилляра погружают в разбавленный раствор едкого натра, а анодный конец — в разбавленный раствор фосфорной кислоты. При наложении напряжения сначала протекает большой поток, поскольку амфолиты еще движутся до своей изоэлектрической точки и, тем самым, вносят вклад в общий поток. Окончание фокусировки выражается падением потока до постоянной небольшой величины. После того, как пробы сфокусированы и разделены в капилляре, они должны пройти через детектор. Это достигается в общем случае заменой катодного электролита (сильного основания) на сильно кислотный раствор или заменой анодного электролита (сильной кислоты) на сильное основание.