Во второй половине XVI в. в странах Европы началось религиозно-политическое движение против Реформации – контрреформация. Программу борьбы с реформационным движением Ватикан разработал на Тридентском соборе (1545–1563 гг.). Ватикан сделал ставку на появившийся благодаря усилиям испанского дворянина Игнатия Лойолы орден иезуитов и инквизицию. Был создан Индекс запрещенных книг (Index librorum prohibitorum) – издававшийся до 1966 г. Ватиканом официальный перечень книг, чтение которых католическая церковь запрещала верующим под угрозой отлучения. Сейм Речи Посполитой в 1668 г. отход от католичества приравнял к государственным преступлениям, за которые предусматривалась конфискация имущества и изгнание из страны, а с середины XVIII в. – смертная казнь. В связи с этим феодалы начали отходить от Реформации. Это привело к сокращению протестантских общин в ВКЛ (к 1696 г. здесь остался 51 протестантский сбор). Сама контрреформация в Великом княжестве Литовском не приобрела таких жестоких форм, как, например, Варфоломеевская ночь во Франции, когда с 23 на 24 августа 1582 г. было вырезано около 20 тыс. протестантов, или сожжение еретиков на кострах инквизиции. Не произошло в Беларуси и такого резкого сокращения протестантских общин, как в Польше. Этому способствовала более толерантная политика правящих кругов ВКЛ, где в отличие от Польши с ее моноконфессионализмом наблюдалась традиция сосуществования двух, а в XVII в. и трех христианских церквей со своими правами. К середине XVII в. антитринитаризм в Речи Посполитой был запрещен законодательно.
При Жигимонте III Вазе (1566–1632) иезуиты добились закрытия протестантских типографий и начальных школ. Процесс окатоличивания высших слоев, втянутых ранее в Реформацию, приобрел массовый характер. В 1770-х гг. на территории ВКЛ было около 90 иезуитских учреждений. Для подавления реформационного движения в ВКЛ иезуиты использовали свои коллегиумы, резиденции и миссии, которые вели проповедническую и образовательную деятельность. Большое значение придавалось благотворительной деятельности (организации приютов и госпиталей).
Реформация так активно воздействовала на религиозные процессы, что это привело к религиозному противостоянию, несмотря на то, что Гродненский сейм 1568 г. уравнял в правах всю шляхту христианской веры. Тем не менее с Реформацией связано дальнейшее развитие книгопечатания, литературы и искусства, что объяснялось подрывом сложившихся схоластических представлений о человеке и Вселенной и стремлением выйти из-под тотального контроля Ватикана.
Распространение Реформации и укрепление позиций католической церкви после Тридентского собора совпали с кризисными явлениями в православной церкви Речи Посполитой. Особенность положения православия в XVI в. состояла в том, что церковная жизнь регулировалась не только духовенством, но и светскими лицами: королем, отдельными светскими землевладельцами, горожанами. Фактически отношения патроната распространялись на все уровни церковной структуры: митрополии и епископии, патроном которых выступал сам монарх; монастыри и приходы, по отношению к которым патронат могли осуществлять частные лица, даже католики. Патронат под разу мевал право светского лица представлять своего кандидата на церковную должность, распоряжаться имуществом данного церковного учреждения, вмешиваться в церковную юрисдикцию, даже если это лицо имело низкий уровень собственно религиозной культуры. К тому же с конца 1580-х гг. обострился конфликт между православной иерархией Речи Посполитой и православными братствами. Последние отстаивали право мирян участвовать в управлении церковными делами, отстаивать интересы церкви перед инославной (от – иначе славить Бога) властью. Братства и наиболее активная часть православного духовенства стремились к переменам, к оздоровлению церковной жизни. В свою очередь православные иерархи, среди которых из-за нездоровых церковно-государственных взаимотношений оказались люди, не видевшие в православном вероучении главную ценность, жаждали прежде всего сохранения собственных привилегий. Они видели возможность решения конфликта с братствами и усиления своего влияния на прихожан в унии с католической церковью и переходе под юрисдикцию папы римского. Уния признавалась ими возможной при сохранении неприкосновенности традиций и прав Киевской митрополии и уравнении православного духовенства в статусе и привилегиях с римско-католическим.