Исидор был по происхождению греком. Учился в Константинополе, переписывал книги и делал выписки из сочинений античных авторов, интересовался различными сторонами гуманитарных и естественных наук: трудами античных философов и историков, риториками, пособиями по древнегреческому языку и грамматике, сочинениями по астрономии, прикладной химии и медицине. Письменно благодарил императора Мануила II Палеолога за его возвращение из поездки по Европе, за возобновление деятельности школ, закрытых во время первой осады Константинополя турками (1396–1402), сообщал о нехватке преподавателей.
Около 1410 года уехал из Константинополя в Монемвасию, где принял монашество. Переписывался со многими, в том числе и с митрополитом Фотием Киевским. В 1430-м переехал в Константинополь, стал одним из придворных политиков, считался одним из наиболее ученых представителей столичного духовенства.
В 1433 году делегирован дипломатом Иоанна VIII Палеолога на Базельский собор, куда отправился через Валахию и Венгрию. Путешествие длилось почти год. В Ульме Исидор передал императору Священной Римской империи Сигизмунду два письма от византийского императора и произнес приветственную речь, в которой призвал его приложить все силы для объединения христиан против мусульманской агрессии. На Базельском соборе 24 июля выступил с речью, в которой коснулся ряда проблем в отношениях между церквями, напомнил о единстве «священного Тела Церкви. После возвращения с Базельского собора и известия о смерти митрополита Герасима (1435) был рукоположен в епископский сан и поставлен на Киевский престол для руководства епископами Черниговской, Полоцкой, Владимирской, Турово-Пинской, Смоленской, Галицкой, Перемышльской, Холмской, Луцкой и Брянской епархий (в Польше и Литве), Новгородской, Тверской и Рязанской епархий (в Новгородской республике, Великом княжестве Тверском и Великом княжестве Рязанском), Ростовской, Владимиро-Суздальской, Коломенской, Пермской епархий (в великом княжестве Московском). Теперь, читатель понимает, какую власть имел Киевский митрополичий престол, хоть и находился в Москве. 2 апреля 1437 года с ближайшим помощниками и свитой Исидор прибыл в Москву.
Причиной поспешного поставления Исидора была необходимость обеспечить поддержку Киевской митрополии и московского князя в проведении Флорентийского собора. В Москве его неприязненно встретил великий князь московский Василий II Тёмный, так как поставлен Исидор был против его воли. Однако, будучи опытным дипломатом, за два месяца Исидор сумел убедить великого князя в необходимости созыва нового Вселенского собора, на котором православные должны были убедить католиков (латинян) отказаться от догматических нововведений, что послужило бы спасению Византии и Греческой церкви.
Получив от Василия II деньги и 100 человек свиты, Исидор отправился в Западную Европу на Собор. В Твери был встречен с почестями князем Борисом Александровичем и епископом Илиёй, через месяц в Новгороде – архиепископом Евфимием и посадниками. Затем почти два месяца в Пскове служил обедню в Троицком соборе, затем в Юрьеве, где наряду с католическими храмами было две православных церкви, и 4 февраля 1438 года прибыл в Ригу. Подробно описываю путь Исидора, чтобы читатель осознал, какую территорию заселял православный люд. 7 мая на корабле митрополит отплыл в Любек вместе с епископом Суздальским Авраамием, тверским послом Фомой Матвеевичем, архимандритом Вассианом и с неизвестным автором текста «Хождение на Флорентийский собор». Греческая делегация 20 дней находилась в Венеции и в конце февраля приняла решение о проведении Вселенского собора не в Базеле(500 км от Венеции), а в Ферраре (100 км от Венеции). 18 августа, по прибытии в Феррару, вручил Папе Евгению IV саккос со сценами из византийской иконографии (хранится в сокровищнице Святого Петра в Ватикане).
5 июля 1439 года Исидор поставил свою подпись митрополита Киевского и всея Руси и местоблюстителя апостольского престола святейшего патриарха Антиохийского под Соборным определением после автократора ромеев Иоанна Палеолога и двух представителей патриарха Александрийского.
Греческое духовенство признавало главенство Папы Римского и основные латинские догматы, император и духовенство надеялись получить от Запада право на автономное самоуправление и проведение богослужений по византийскому обряду. Митрополит Исидор был одним из главных участников собора и сторонником унии, оказавшейся впоследствии малорезультативной: простой народ и духовенство не приняли ее. В Византии сторонниками унии по политическим мотивам оставались только двор императора и назначенный им патриарх.
Еще одной причиной провала унии называют ее провозглашение Флорентийским собором под руководством Папы Евгения IV, власть которого не признавали многие государи Европы, а также Речь Посполитая (в ее входила западная часть Киевской митрополии).