Мальтийский орден (как стал с этих пор называться орден госпитальеров) продолжал проводить активную антитурецкую деятельность, практически он стал форпостом христианских держав в борьбе с Османской империей, достигшей к этому времени апогея своего могущества. Вскоре после переселения на остров рыцари помогли императорскому флоту овладеть африканской крепостью Галетой. В 1531 году они участвовали в экспедиции в Южную Грецию, а в 1535 – в Тунис. В 1541 году мальтийские рыцари поддержали императорские войска, уже отступавшие под натиском алжирцев. Мальта располагала великолепной гаванью и, находясь между испанской Сицилией и османской Африкой, представляла собой прекрасную базу для ведения военных действий на море против турецких армад и африканских корсаров. Рыцари договорились о беспошлинном ввозе зерна из Сицилии и укрепили гавань. Они привезли с собой с Родоса свои реликвии п часть архива ордена и продемонстрировали замечательную способность приспосабливаться к новым условиям без ущерба для фундаментальной структуры орденского государства (из чего следует, что существование военно-монашеского ордена не обязательно зависит от его террториального местонахождения). В 1551 году Триполи был захвачен турками, а мальтийский остров Гоцо подвергся разрушительному нападению. Но рыцари продолжали воевать. Наивысшего расцвета Мальтийский орден достиг в правление великого магистра Жана де ла Валлетта (1557–1568), ветерана последней осады Родоса в 1522 году при котором Мальте пришлось выдержать страшную осаду турок. К моменту нападения османов крепость Сент-Анжело, новый город Изола и форт Сент-Эльмо при входе в гавань были уже хорошо укреплены. Турок бы то намного больше, чем защитников острова, но благодаря тому, что Жан де ла Валлетт был опытным и отважным воином и талантливым военачальником и ему помогало все мальтийское население, Малы-, продержалась до прибытия спасательной экспедиции под командованием вице-короля Палермо и командора ордена Сантьяго Гарспа дг Толедо. После четырехмесячной осады турки были вынуждены отступить, потеряв свыше двадцати тысяч человек.
Шесть лет спустя, когда турки потерпели поражение при Лепанто пять галер и 100 рыцарей были присланы новым военно-монашеским орденом, посвященным святому Стефану. Этот орден был основан в 1562 году Козимо I де Медичи, герцогом Тосканы, ставшим его первым великим магистром (эта должность в ордене была наследственной) Козимо превратил необольшую тосканскую флотилию в регулярную сильную эскадру по образцу мальтийской. Он хотел защитить свое побережье и морское судоходство и к тому же сплотить вокруг себя своих подданных-нефлорентийцев, новую привилегированную прослойку из членов созданного им ордена. В некоторых городах, находившихся в оппозиции Флоренции, таких как Сиена и Лукка, знать осталась верна Мальте, но в других местах ордену святого Стефана удалось переманить у госпитальеров целые семьи, хотя новый орден и не пользовался таким престижем. Рыцари могли вступать в орден святого Стефана и закреплять за собой статус знатного дворянина, взяв новое командорство под семейное покровительство; они могли вступать в брак как п члены ордена Сантьяго; они должны были нести военную службу в течение как минимум трех лет. Сыновья женатых командоров могли получить в наследство командорство, находившееся под семейным покровительством, а изъяны в происхождении их матерей можно было исправить дополнительными денежными взносами; более того чем ччще командоры отказывались от своих должностей, тем быстрее могли завоевать себе знатный статус члены тех же семей. Все это, вместе взятое сильно отличалось от мальтийских представлений об образе жизни монашествующих рыцарей и о знатности происхождении, но нельзя не признать, что орден святого Стефана активно участвововал в священной войне на море.