На первом этапе освоения украинцами Слобожанщины большое значение имела монастырская колонизация. Видимо, монахи из Киева были первыми жителями на территории будущей Слободской Украины после монгольского опустошения. И приоритет в освоении края принадлежал украинцам. Например, согласно преданию, часть монашеской братии Киево-Печерского монастыря после разорения Киева в 1240 г. переселилась на берега Северского Донца и основала здесь Святогорский монастырь. Первое же письменное упоминание о нем относится к 1624 г., когда российский царь даровал обители жалованную грамоту. Монастырь получил во владение обильные окрестные земли, угодья и являлся важным оборонительным пунктом. Во время Смуты находившаяся вблизи крепость Царев-Борисов опустела, и Святогорский монастырь оказался самым южным пунктом России на крымском направлении. Существовали на территории Слободской Украины и другие монастыри, основанные выходцами из Украины. Так, в 1640 г. 15 монахов во главе с настоятелем Гурием пришли вместе с Я. Остряниным на р. Тихая Сосна и создали Дивногорский монастырь. Известно, что под его стенами в сентябре 1670 г. произошло решающее сражение между разинцами и царскими войсками. В 1654 г. бежавшие казаки Корсуньского полка основали Краснокутский Петропавловский монастырь. В этом же году монахи Лебединского монастыря во главе с игуменом Иоанникием основали Ахтырский Троицкий монастырь. В 1667 г. полковник Харьковского полка Григорий Донец основал Куряжский Преображенский монастырь. С середины XVII в. известны на Слобожанщине Шатрищенский (или Шатрищегорский) Преображенский и Змиевский монастыри.
Возникновение Слободской Украины и формирование казачьих полков
Новая волна украинской колонизации началась в 1638 г. после поражения восстания казаков во главе с Яковом Остряниным и Дмитрием Гуней. Я. Острянин в июне 1638 г. возглавил группу из 900 казаков с семьями, которая переселилась в российскую область под управлением белгородского воеводы. На правом берегу р. Северский Донец он основал Чугуевский острожек (впоследствии — город Чугуев). В мае 1641 г. во время похода на татар казаки восстали и убили своего предводителя, так как желали вернуться в Правобережную Украину, чему атаман противился. Жители Чугуева ушли на правый берег Днепра, а в опустевшем остроге были поселены российские стрельцы и казаки. В сентябре 1642 г. польские власти, чтобы предупредить бегство украинцев на территорию России, основали возле горы Ахтырь г. Ахтырка, которому через 16 лет суждено было стать вторым полковым центром Слободской Украины.
Мощный всплеск переселения украинцев в Слободскую Украину породили военные лишения времен «Освободительной войны украинского народа середины XVII в.». Украинцы бежали в порубежную российскую область, где природно-климатические условия жизни были близки к условиям прежних мест расселения. Так, на Слобожанщину в 1652 г. из окрестностей Острога на Волыни привел большую группу украинских переселенцев черниговский наказной полковник Иван Дзиковский. С ними была 1 тыс. казаков Черниговского полка с семьями и всем имуществом. На берегу р. Тихая Сосна ими был основан Острогожск (или Рыбное) и первый слободской казачий полк — Острогожский. Полк был устроен по общему для украинских казаков образцу.
Жители Острогожского полка получили от белгородского воеводы грамоту, закреплявшую их права и вольности. Проблемой стало наличие в самой Острогожской крепости российского воеводы, с которым И. Дзиковский постоянно конфликтовал из-за вмешательства в дела полка. В итоге в 1670 г. полковник примкнул к восстанию С. Разина. Однако значительная часть полковой старшины не поддержала восстание и составила заговор против полковника. В сентябре 1670 г. он был захвачен группой заговорщиков и выдан российским властям. По приказу белгородского воеводы князя Г. Г. Ромодановского в сентябре 1670 г. основатель первого слободского полка был расстрелян. Между тем, несмотря на широкую поддержку, которую получили разинцы в Слободской Украине, уже в октябре 1670 г. они были разбиты.
Колонизационное движение, начатое И. Дзиковским, было поддержано последующими потоками переселенцев. В 1653 г. казаки Белоцерковного полка из м. Ставище во главе с Герасимом Кондратьевым основали поселение Сумы, где в 1656—1658 гг. была воздвигнута крепость. Формирование полка завершилось лишь в 1665 г., когда был учрежден Сумский полк. Вторым слободским казачьим полком стал Ахтырский (учрежден в 1658 г.) во главе с полковником Иваном Гладким. В 1654 г. группой казаков во главе с Иваном Каркачем был основан Харьков, в котором уже через год проживало около 2 тыс. жителей. В 1659 г. возник Харьковский полк (правда, существует версия, что этот полк мог быть основан еще в 1651 г. с центром в м. Мерефа).