После объявления Брестской унии начинается новый этап борьбы за православие. Поражение казацкого восстания усложняло ситуацию. Уния теперь активно распространялась как путем проповеди, так и путем насилия. В начале 1597 г. константинопольский экзарх Никифор, присутствовавший на Брестском соборе, был обвинен в шпионстве, посажен в крепость и там умер.
Братства предпринимали совместные акции по защите православной веры, в том числе отправку объединенной делегации к королевскому двору.
Одновременно началась и религиозная полемика. Иезуит Скарга издал «Synod Brzeski і iego obrona». В ответ Христофор Фалалет Вронский, член Острожского кружка написал «Апокризис, альбо отповедь на книжки о соборе берестейском», опровергавший книгу Скарги. В нем рассматривались такие актуальные в тот момент вопросы, как отношения паствы и епископов, собора и иерархии т. д. Православный львовский священник, бывший на Брестском соборе, написал «Пере-строгу», т. е. предостережение, в которой в частности, рассказывал, как на самом деле была введена уния. В 1610 г. Мелентий Смотрицкий издал «Fmvox», плач православной церкви по поводу отступничества от нее детей. Впервые украинские православные деятели оказались способными вести научную полемику, ни в чем не уступая своим католическим противникам.
Не находя поддержки у правительства, православные заключили в 1599 г. союз с протестантами, с целью противодействовать католикам и униатам. В том же 1599 г. новым униатским митрополитом был назначен Потей, который энергично занялся распространением унии, пользуясь тем, что на его стороне всецело была светская власть.
Потей вел борьбу с православными епископами и монастырями, отнимал у них имения, лишал духовные лица их мест и замещал их униатами. Разгромив православие в Вильно, он вознамерился сделать то же самое в Киеве. Не один раз он делал попытку завладеть Киево-Печерской лаврой, но это ему не удавалось благодаря энергичному сопротивлению архимандрита Никифора Тура, который просто не пустил Потея (1599 г.). Упорную борьбу вели православные с униатами и за право владения Софийским собором.
После смерти в 1608 г. князя Константина Острожского, главной силой, которая выступала защитниками православия в украинских землях, становятся казаки. В 1610 г. казацкий гетман Григорий Тусканевич прямо предупредил киевского войта, что если представитель униатского митрополита вздумает притеснять местное духовенство и мешать свободному отправлению богослужения, то будет убит казаками «яко пес». С помощью казаков архимандрит Никифор Тур в 1614 г. отстоял все владения Киево-Печерского монастыря.
Между тем, после поражение восстания С. Наливайко положение казачества было сильно ослаблено. Часть из них ушла в Запорожье. другая разошлась по городам. Но внешнеполитическое положение Речи Посполитой вскоре заставило польские власти искать новое соглашение с казаками. В 1600 г. казацкий гетман Самойло Кишко с 4000 казаков по просьбе короля ходил на Молдавию, а затем в Ливонию против шведов.
В 1604–1612 гг. украинские казаки принимали самое активное участие в событиях русской Смуты. Наряду с польской шляхтой многие из них отправились искать счастье в Московское государство. Только с Дмитрием Самозванцем в 1604 г. на Москву пошло 12 000 украинских казаков — там были и реестровые, и запорожцы и примкнувшие к ним «показаченные».
Эти походы имели и обратную сторону медали. Польское правительство не соглашалось увеличить размер реестра свыше 1000 человек, а в войне приняли участия десятки тысяч «показаченных». По окончанию войны все они остались без доходов и средств к существованию. Начинались грабежи и разбои, что не приносило славы казацкому имени. Прекратить анархию в казацкой среде и создать регулярную армию, ставшую грозной военной и политической силой в Речи Посполитой удалось Петру Конашевичу по прозвищу Сагайдачный.
Родился будущий гетман примерно в 1570 г., в селе Кульчица Сам-борского повета воеводства Руського, в Галиции. Он происходил из семьи украинского шляхтича Коиона из рода Конашевичей-Попелей герба «Побуг» и Пелагеи. Прозвище свое он получил позже, уже на Запорожье: «сагайдаком» татары называли колчан для лука и стрел.
Сагайдачный закончил полный курс Острожского коллегиума и даже написал в свои студенческие годы полемический труд «Поясне-ния про унию», вызвавший такой отклик, что о нем упоминал литовский канцлер Лев Сапега в своем письме к полоцкому архиепископу Иосифу Кунцевичу.
Из Острога Сагайдачный переехал в Киев, где некоторое время работал домашним учителем у городского судьи Яна Аксака. Затем, примерно в 1601 г. он бросил свою работу и уехал в Запорожье, принял участие в Молдавском и Ливонском походах. Выдающиеся военные и организаторские способности, огромная трудоспособность выдвинули его в среде казаков. Сагайдачный стал гетманом и удерживал за собой это звание с небольшими перерывами десять лет.