В областях своей легатуры, равно как и в 40-е гг. на территории Византийской империи, Исидор пропагандировал Флорентийскую унию, используя специальный, разработанный им лично, метод убеждения, в соответствии с которым для привлечения православных он апеллировал исключительно к византийскому святоотеческому наследию. На территориях, подвластных ему как Киевскому митрополиту, известие об объединении Церквей воспринималось настороженно-скептически, а где-то и наталкивалось на жесткое неприятие. В Москве из-за объявленного соединения произошел жесткий конфликт между великим князем Василием Васильевичем и митрополитом-кардиналом Исидором, в результате которого последний был заключен в тюрьму и Собором русских епископов лишен сана. С подобной ситуацией в Русском государстве сталкивались впервые, потому, видимо, предоставили Исидору возможность бежать из заключения. Личность и деятельность Исидора на Руси надолго запомнились русским людям, и отныне каждый раз, когда только его имя упоминалось в каком-либо сочинении, оно сопровождалось какой-нибудь нелестной характеристикой, отражающей негативное к нему отношение. В лице Исидора была скомпрометирована и Константинопольская Церковь, что, несомненно, сыграло свою роль в установлении автокефалии Русской Церкви в 1448 г. при свт. Московском Ионе.
Изучение последнего периода жизни Исидора связано с рядом проблем, однозначное разрешение которых порой казалось невозможным. В первую очередь это недостаток опубликованных источников по жизни Римской курии в 40–60-е гг. XV в. и в целом плохая изученность в историографии вопроса о созыве Мантуанского Собора и греках в Италии после падения Константинополя. На основании изучения имеющихся источников мы установили, что последний период жизни Исидора связан с пропагандой унии на территории Византийской империи и полноценной деятельностью на посту кардинала Римской Церкви сперва в чине кардинала-пресвитера, а с 1451 г. — кардинала-епископа. Римские папы одаривали его различными благодеяниями, передавая Исидору «в кормление» храмы, монастыри и целые епархии. Под конец жизни, с 1459 г., «кардинал Рутенский» стал латинским (титулярным) патриархом уже захваченного турками Константинополя, за судьбу которого так отчаянно сражался в 1453 г., принимая активное участие в его обороне от натиска турецких войск. В результате военных действий кардинал Исидор чуть было не погиб, был продан в рабство, но, оставшись неузнанным из-за полученной раны головы, счастливо избежал уготованной ему султаном казни и сумел спастись. С падением столицы Ромейского государства вопрос унии Церквей потерял свою первоначальную актуальность, однако до конца своих дней кардинал Исидор не оставлял надежды на возрождение Империи и отчаянно делал для этого все возможное. В 50–60-е гг. XV в. он вместе с Виссарионом Никейским и Римскими папами Николаем V, Каллистом III и Пием II пытался организовать Крестовый поход против турок, участвовал в работе Мантуанского Собора, однако эти усилия не привели к чему-то значительному. Последние дни своей жизни он провел в Риме, где и был похоронен сперва в церкви Свв. апостолов, а затем в кафедральной базилике Св. ап. Петра.