Орден воспрял духом благодаря возникновению нового братства. В 1561 году великий герцог Тосканы Козимо I основал орден Святого Стефана с бенедиктинским уставом и миссией воевать с корсарами. Рыцари ордена делились на четыре разряда: рыцари с четырьмя доказательствами благородного происхождения, которые давали обеты бедности, милосердия и послушания, носили белый плащ с розовой подкладкой и красный мальтийский крест с золотыми краями на левой стороне груди; капелланы в белой сутане и капюшоне, с крестом с желтыми краями; служащие братья в белом саржевом одеянии с простым красным крестом; и сестры. Пост магистра по наследству передавался между великими герцогами, рыцари могли жениться и не должны были постоянно соблюдать монастырские обязанности; бейлифы, включавшие в себя коннетабля, адмирала, великого приора, канцлера, казначея, хранителя и приора обители, избирались на три года. Козимо сделал рыцарям великолепные дары, он поручил художнику и архитектору Джорджо Вазари возвести красивую церковь и обитель в Пизе, первую увесили турецкими трофеями, а вторую украсили фресковой потолочной росписью в память о Лепанто. Однако эти рыцари позднего Возрождения были не просто украшением; многие холостые братья жили в обители, и их галеры с энтузиазмом сражались вместе с мальтийскими.
В 1564 году Ромегас перехватил большую турецкую каракку, шедшую из Венеции в Константинополь с грузом в 80 тысяч испанских дукатов. Поскольку корабль принадлежал кизляр-аге, начальнику черных евнухов, и доля груза принадлежала «императорским одалискам», в султанском дворце разразился большой скандал. Между тем пожилая турецкая «дама высокого звания», захваченная раньше, посылала с Мальты жалобные письма. Сулейман, уже старый, подавленный мятежом сына и смертью любимой жены, легко пришел в ярость; «даритель мира земного» не мог больше терпеть пиратов-неверных в «своем» турецком море. Тургут, неуязвимый противник братьев, преувеличивал их слабость, поэтому султан отправил своих военачальников совершить нападение на Мальту менее чем с 30 тысячами человек. Однако это были наилучшие воины имперской армии: во главе с 6 тысячами отборных янычар с длинными дамасскими мушкетами, за ними 9 тысяч сипахов, ударных войск, в резком контрасте, феодальные войска, которые, видимо, напоминали полки Порты, в алой, желтой или темно-синей парче, всадники с луками из рога, хотя у них были и ружья, и они умели драться пешими. Также с ними было 6 тысяч корсаров и моряков, не так великолепно обмундированных, и 3 с половиной тысячи ненасытных акинджи, добровольцев, которые занимались грабежами. Самыми грозными были 4 тысячи гази-дервишей, берсерков, употребляющих гашиш.
Этим войском командовали два военачальника: престарелый Мустафа-паша, ветеран Родоса, и молодой Пияле-паша, сербский найденыш, женившийся на османской царевне и ставший капудан-пашой, то есть главным адмиралом турецкого флота. В их штаб также входил Улудж Али, будущий герой Лепанто, и многие знаменитые корсары, но, несмотря на такие таланты и присутствие личного штандарта Сулеймана – большого серебряного диска с золотым шаром и полумесяцем и неизменными конскими хвостами, экспедиции сильно помешало это разделение командования. Однако пушки в 1565 году были эффективнее прежних, усовершенствовались и мушкеты, и янычары стали опытными стрелками; их оружие с длинными стволами и колесцовыми замками, сделанное в Константинополе немецкими оружейниками, заряжалось не так быстро, как более короткие европейские аркебузы, но било оно точнее. Шпионы сообщали, что артиллерия разрушит импровизированную оборону Мальты всего за несколько дней.
Агенты ордена не могли не заметить кипучую деятельность на верфях и в арсеналах Константинополя. Членов ордена вызвали из Европы, в подвалы, устроенные в скалах под Сан-Анджело, свезли большие запасы провизии и пороха. На Мальте осаждающие не могли с легкостью найти себе пропитание; крестьяне собрали все посевы и отравили колодцы, побросав в них паклю и гниющие потроха. Мдине, хорошо укрепленной, с гарнизоном из ополченцев, предоставили самой позаботиться о себе. В распоряжении брата Жана было 600 братьев – община из 474 рыцарей и 67 служащих братьев плюс новоприбывшие, а также 1200 итальянских и испанских наемников и 3000 мальтийских ополченцев. Других доступных войск, включая галерных рабов и греков – жителей острова, насчитывалось 1300 человек. Всего его силы составляли 6 тысяч человек, из которых меньше половины были профессионалами. А кроме того, сицилийский вице-король дал Филиппу II слово, что 25 тысяч человек придут на помощь обители.