Оборона Родоса, как и в 1480 г., была распределена между орденскими «языками» и на деле мало чем отличалась от прежнего расклада, за исключением перемены местами англичан и испанцев. В целом схема организации обороны была следующей: от башни Найяка до ворот д’Амбуаза участок Франции (прежний участок Великого магистра был им поглощен); отсюда до бастиона Св. Георгия, не включая его, – участок Германии; затем, от георгиевского бастиона до башни Испании – участок Оверни; далее до башни Богоматери – участок Испании (прежний английский); оттуда до ворот Св. Иоанна – участок Англии (прежний арагонский); далее до башни Италии – участок Прованса; оттуда до башни Ветряных Мельниц – участок Италии; наконец, участок Кастилии и Португалии шел от башни Ветряных Мельниц и вместе с тем от ворот Св. Екатерины до башни Найяка. Врага были готовы встретить 7500 вооруженных родосцев, из них рыцарей – около 290, сарджентов – порядка 300, 400 критских и 500 итальянских наемников, остальные – местные жители, представленные милицией, состоящей из отдельных отрядов сообразно этническому происхождению, профессиональной деятельности и т. д.: самым многочисленным был еврейский отряд (250 человек), за ним – отряд мясников и т. д. В прибавлении к жизнеописанию д’Обюссона приведена численность рыцарей перед осадой согласно их принадлежности к «языкам»: 51 рыцарь от «языка» Прованса, 26 – Оверни, 62 – Франции, 47 – Италии, 51 – Арагона, Каталонии и Наварры; 11 – Англии (по данным Дж. Смита, их было больше – 20 или даже больше), 6 – Германии, 57 – Кастилии и 13 в форте Св. Николая (вместо 20 по другим данным), итого – 324 (вместо заявленных выше 290). Возможно, разницу в цифрах можно привести в относительное согласие, если учесть, что впоследствии в крепость прорвались, усилив гарнизон, еще 50 рыцарей и 200 воинов и моряков. Рыцарь дю Меснил командовал обороной бастиона Оверни, Франциск де Карриерес – бастиона Испании, Беранже де Лионсель – бастиона Прованса, Анджело Джентили – бастиона Италии. Обороной английского участка крепости заведовал Уильям Уотсон (Уазон или Онаскон), английского бастиона – Николас Хасси; Томас Шеффилд возглавлял оборону ворот Св. Антония. Брат Раймон де Рикар, старейший командор ордена, оборонял участок стен «языка» Прованса, Раймон Роже – Оверни, Иоахим де Сент-Обен – Франции, Вальднерс – Германии, Джорджо Эмар – Италии, Хуан де Барбара – Кастилии, Эрнан Соллиер – Арагона. Л’Иль-Адан избрал себе, как некогда д’Обюссон, адъютантов из столпов ордена, и среди них – предателя д’Амарала. Англичанин Джон Бак, туркопольер, отвечал за посты Испании и Англии; приор Франции Пьер де Клюи отвечал за посты Франции, Кастилии и Португалии; приор Наварры Грегуар де Моргут отвечал за посты Прованса и Италии; канцлер д’Амарал отвечал за посты Оверни и Германии; лейтенант магистра брат Габриэль де Поммерос не имел определенной зоны ответственности, но просто был обязан появляться там, где была необходимость. Ту же обязанность возложил на себя Великий магистр, предводительствуя отрядом своих телохранителей, возглавляемых овернским рыцарем де Бонневалем. Четырем столпам были приданы помощники – французы Анастасий де Сент-Камелль, Гийома Даза и испанцы Марин Фурфан и Раймонд Маркет, каждый распоряжался отрядом в 150 человек. Обороной форта Св. Николая – ключа от Родоса – руководил Гийом де Кастелан из «языка» Прованса, старый рыцарь, отличившийся во многих сражениях, начальствовавший над 20 прованскими рыцарями и 300 воинами. Город посменно патрулировали 600 человек под руководством французов Клода де Сен-При и Жана Бонифаса и испанцев Лопеса д’Айялы и Гуго Капона. Великий штандарт ордена был вручен Антуану де Гроле, штандарт с распятием – рыцарю Тинтвиллю, штандарт Великого магистра – рыцарю Анри де Мозеллю.
Ожидая, как и в 1480 г., основных атак с моря, Великий магистр взял себе для защиты наиболее уязвимый участок крепости – тот самый, у еврейского гетто, где в прошлую осаду прорвался враг и где д’Обюссон потом выстроил церковь Богоматери Победы.
Султан прислал на Родос следующее объявление войны (оно было брошено на рыцарскую галеру, привязанным к камню), как оно записано у аббата (пер. с англ. –