Иными мотивами руководствовалось Великое княжество Литовское. Здесь решающую роль играла заинтересованность литовских и белорусских феодалов в свободной продаже продуктов своих поместий западноевропейским купцам. Властям Великого княжества, несмотря на заключение Виленского договора, пришлось выдержать долгую и напряженную борьбу с Ригой за овладение устьем Западной Двины, что объективно не противоречило стремлению Российского государства контролировать торговый путь, шедший на запад по побережью Финского залива. Не сталкивались интересы обеих стран и на международном рынке — Россия в XVI в. не экспортировала ни хлеб, ни лесные товары — главные предметы сбыта белорусских, литовских и польских феодалов. Однако на отношения обеих держав сильнейший отпечаток накладывал конфликт из-за белорусских и украинских земель. Правительство Великого княжества не желало допустить усиления России с ее выходом к Балтийскому морю. Его пугали быстрое развитие нарвской торговли, непосредственный контакт русских купцов с западноевропейскими. Поэтому оно выступило с притязаниями на все наследие Ордена и прилагало усилия для блокады Нарвы.
Политики из окружения Сигизмунда II стремились к власти над Северной Эстонией, чтобы подчинить своему контролю торговые пути, ведущие в Россию. Столкнувшись с трудностями в достижении этой цели, Сигизмунд II и его советники проявили готовность добиваться своего даже ценой ослабления иных важных позиций, завоеванных Ягеллонами на Балтике. По соглашению 1563 г. в обмен на поддержку со стороны бранденбургского курфюрста в Ливонии правящая в Бранденбурге линия Гогенцоллернов приобрела права наследования прусского престола в случае пресечения потомства Альбрехта; этим были созданы предпосылки для будущего объединения Бранденбурга и Пруссии в единое государство, ставшее одним из самых опасных врагов Польши. Такая политика сделала войну между Ррссией и Великим княжеством Литовским неизбежной.
В этой войне русскому правительству удалось разъединить действия противников и, заключив мирные соглашения с Данией и Швецией, сосредоточить силы на войне с Сигизмундом II, оказавшимся в конфликте со шведским королем Эриком XIV. Уже в самом начале военных действий проявилось явное превосходство русской военной организации, ее умение быстро сосредоточить крупные людские и материальные ресурсы. В 1563 г. русские войска заняли Полоцк — это был-«крупный шаг вперед по пути к воссоединению белорусских земель и одновременно сильный удар по позициям Великого княжества: путь в Балтийское море по Западной Двине был перерезан. Но позднее международное положение изменилось неблагоприятным для Российского государства образом. Возникла угроза прямого вмешательства Польского королевства в произошедший конфликт. В критическом положении литовские магнаты обратились за помощью в Польшу. Русская политика объединения всех восточнославянских земель в одном государстве затрагивала также интересы польских феодалов, под властью которых с XIV в. находилась значительная часть украинских земель. Стесненное положение Великого княжества давало возможность польским феодалам осуществить их собственные политические планы: с конца XIV в. польские феодалы стремились лишить его политической самостоятельности и открыть себе возможности для колонизации белорусских и украинских земель, входивших в его состав. До сих пор такие попытки наталкивались на упорное сопротивление господствующего класса Великого княжества. Теперь успеху этих планов способствовали надежды литовской шляхты, что политическое сближение с Польшей позволит ей ограничить власть магнатов и приобрести такое же политическое влияние, каким располагала польская шляхта. По Люблинской унии 1569 г. Польша и Великое княжество Литовское объединились в одно государство — Речь Посполитую, однако при формальном равноправии сторон ведущая роль принадлежала польским феодалам. Великое княжество утратило украинские земли, вошедшие непосредственно в состав Польского королевства, которое стало соседом Российского государства. С продолжением войны в ней теперь неизбежно должна была принять участие уже не только вспомогательными отрядами, но и своими основными силами Польша, что резко меняло соотношение сил не в пользу России.