Александрийский патриарх Мелетий I Пигас, бывший в то время местоблюстителем Константинопольского патриаршего престола, пытался сопротивляться унии через экзарха Константинопольского Патриархата протосингелла Никифора и путем назначения своими экзархами трех других лиц — епископа Львовского Гедеона, Кирилла Лукариса и князя Константина Острожского. Однако король Сигизмунд решительно противился избранию православного митрополита. Центрами сопротивления унии в этот период стали монашеские и мирянские братства, такие как Виленское Свято–Духовское братство, в 1610–е годы возглавлявшееся наместником Свято–Духова монастыря Леонтием (Карповичем). Иноком этого монастыря был Мелетий Смотрицкий, автор многочисленных сочинений в защиту православной веры против латинства и униатства: одно из них, называвшееся «Фринос, или Плач Восточной Церкви», пользовалось особой популярностью.
Весной 1620 года в Киев прибыл патриарх Иерусалимский Феофан III, возвращавшийся из Москвы на родину. Вскоре после приезда он издал благословенную грамоту «всем в Православии сияющим, иже в Малой России, изряднее же обывателем Киевским». Осенью того же года, по многочисленным просьбам священников и мирян, он начал рукополагать для Малой России епископов. Сначала на Перемышльскую кафедру был рукоположен игумен Исаия Копинский, затем на Киевскую и Галицкую митрополию игумен Иов Борецкий, и, наконец, в сан архиепископа Полоцкого был рукоположен Мелетий Смотрицкий (спустя несколько лет автор «Фриноса» и знаменитой «Грамматики славянского языка» присоединится к униатству).
Восстановление православной иерархии Киевской митрополии стало причиной новых притеснений со стороны королевской власти и униатских епископов. Одним из главных ревнителей унии в этот период был Полоцкий униатский архиепископ Иосафат Кунцевич. Его трагическая история — одно из многочисленных свидетельств взаимной неприязни православных и униатов. Получив от короля грамоту на подчинение своей власти всех православных монастырей и храмов, Кунцевич стал требовать присоединения к унии от всех священников епархии. Кунцевич не только отнимал храмы у православных, но даже запрещал совершать православное богослужение в частных домах и шалашах, а непокорных священников отлавливал и сажал в тюрьму. 12 ноября 1623 года Кунцевич был зверски убит жителями Витебска, его труп был изуродован и брошен в Двину.
Король ответил на убиение Кунцевича жестокой карой: девятнадцати гражданам были отрублены головы, около сотни других жителей города, успевших бежать, были приговорены к смерти заочно. Папа Урбан VIII, не зная о том, что казнь уже состоялась, в письме от 10 февраля 1624 года требовал расправы над виновными в убийстве Кунцевича: «Жестокость убийц не должна остаться ненаказанной. Там, где столь тяжкое злодеяние требует бичей мщения Божия, да проклят будет тот, кто удержит меч свой от крови. И ты, державный, не должен удержаться от меча и огня; пусть ересь почувствует, что жестоким преступникам нет пощады». В 1643 году папа Урбан VIII беатифицировал Кунцевича, а в 1867 году Пий IX причислил его к лику святых, провозгласив духовным покровителем Руси и Польши.
В истории Киевской митрополии важную роль сыграл митрополит Петр (Могила). Он был избран на митрополию после смерти в 1632 году короля Сигизмунда III, на протяжении 45 лет возглавлявшего Речь Посполитую и активно поддерживавшего унию. В 1633 году, получив грамоту на митрополию от нового короля Владислава IV, Могила прибыл в Киев и приступил к церковным делам, пришедшим в полное расстройство в годы гонений на Православие. Прежде всего он привел в порядок собор Святой Софии и восстановил несколько других древних храмов. Киево–братское училище он преобразовал в коллегию и превратил в крупный центр духовного образования. Преподавание в Киевской коллегии велось на латинском языке, и в основу учебных курсов были положены книги, составленные по схоластическим образцам. Первым ректором коллегии стал Исаия Козловский, автор знаменитого «Исповедания православной веры», вошедшего в историю под названием Катехизиса Петра Могилы и составленного в опровержение «Исповедания» Константинопольского патриарха Кирилла Лукариса. Труды митрополита Петра Могилы по упорядочению православных богослужебных чинопоследований, в которые вкрались латинские и униатские обычаи, увенчались изданием «Требника»: в него были включены не только тексты чинопоследований православных Таинств и обрядов, но и комментарии к этим текстам.
В 1654 году Украина вошла в состав России, а спустя тридцать лет, в 1685 году, при патриархе Московском и всея Руси Иоакиме, Киевская митрополия присоединилась к Московскому Патриархату. Вхождение Киевской митрополии в состав Московского Патриархата было в 1686 году признано патриархом Константинопольским Дионисием IV.
Синодальная эпоха в истории Русской Церкви