Конфликт разразился при сыне Михаила Романова, царе Алексее Михайловиче (1629—1676). По инициативе царя в 1652 году на патриарший престол был возведен молодой и энергичный Новгородский митрополит Никон (1605—1681). Биография этого иерарха не характерна для высшего церковного сановника его времени. Он происходил из крестьянской семьи, был приходским священником, затем стал монахом в Анзерском скиту Соловецкого монастыря. В середине 1640–х годов состоялось его знакомство с царем, который сделал его сначала архимандритом московского Новоспасского монастыря, затем Ростовским митрополитом и, наконец, патриархом. Как и Филарет, Никон обладал не только духовной, но и светской властью, и в 1654—1655 годах, во время военных походов царя против Польши, фактически управлял государством. Как и Филарет, Никон имел титул «великого государя».
Алексея Михайловича и Никона на протяжении более десяти лет связывала теплая дружба, но в 1658 году Никон впал в немилость, царь перестал приходить на совершаемые им службы, и Никон, вместо того чтобы попытаться наладить отношения с царем, самовольно и демонстративно оставил патриаршество, удалившись в Новоиерусалимский монастырь. Собор 1660 года принял решение избрать нового патриарха на место Никона, однако Никон не признал решения этого Собора, назвав его «синагогой сатанинской» и «сборищем бесовским».
Добровольно лишившись патриаршества, Никон неоднократно пытался вмешаться в государственные и церковные дела, писал письма царю, а в 1662 году, в неделю Торжества Православия, во время богослужения в своем монастыре предал анафеме митрополита Крутицкого Питирима, местоблюстителя патриаршего престола. «Дело Никона» тянулось в общей сложности более восьми лет, к этому делу были подключены царь, бояре, многие архиереи и даже восточные патриархи. Наконец, в 1666 году в Москве был созван Собор с участием патриархов Александрийского Паисия и Антиохийского Макария. На этом Соборе царь и бывший патриарх впервые после восьми лет встретились друг с другом, однако уже не как друзья, а как противники. Никону были предложены вопросы, он отвечал на них уклончиво или заносчиво, оспаривая права восточных патриархов и называя еретическими греческие церковные каноны. После многодневных и мучительных прений с участием царя и восточных патриархов Никон был низложен, лишен священного сана и отправлен на покаяние в монастырь.
Имя патриарха Никона связано с одной из самых трагических страниц в истории Русской Церкви — возникновением раскола. Став патриархом, Никон продолжил «книжную справу», начатую еще его предшественниками, однако в исправлении богослужебных текстов и церковных обычаев пошел гораздо дальше. В частности, он требовал замены традиционного для Руси двоеперстия (крестного знамения с двумя сложенными перстами) троеперстием, в соответствии с современной ему греческой практикой. Против Никоновой реформы выступили протопопы Иоанн Неронов и Аввакум, которые пользовались популярностью в народе.
В 1654 году Никон созвал Собор, постановивший исправить богослужебные книги в соответствии с греческими и утвердивший троеперстие. Епископ Коломенский Павел пытался было возражать, но Никон низверг его с кафедры и подверг тяжкому телесному наказанию, в результате которого тот сошел с ума. В 1655 году, когда в Москве находились патриархи Антиохийский и Сербский, в которых Никон стремился найти союзников делу богослужебной реформы, после литургии в день Торжества Православия Никон начал собственноручно, на глазах у изумленного царя и народа, уничтожать иконы, написанные по западным образцам, бросая их об пол. Эти действия Никона противниками реформ были расценены как кощунственные, лидеры раскола увидели в Никоне антихриста. Клятвы (проклятия) на старые обряды, наложенные Московским Собором 1656 года, в котором участвовали патриархи Антиохийский и Московский, не воспрепятствовали, а, наоборот, способствовали дальнейшему распространению старообрядчества. Раскол не прекратился и после ухода Никона с патриаршества, и даже после его низложения, поскольку Большой Московский Собор 1667 года, последовавший за низложением Никона, оставил в силе клятвы на старые обряды и одобрил проведенную Никоном реформу.