Древний иконостас сохранялся, вероятно, до 1482 года, а может быть, и до XVI века, когда князем Константином Острожским был устроен новый шестиярусный иконостас, известный по копии, отлитой по благословению Московского Патриарха Никона. В 1896 году его верхние ярусы были сняты, в подражание первоначальной низкой алтарной преграде. До 1941 года в Успенском соборе стоял иконостас времен гетмана Скоропадского (1708–1722), имевший большую художественную ценность. Икона Успения, Печерских святых и другие покрывались роскошными ризами. Вокруг икон были сделаны рамы из звезд. Царские врата были кованные из серебра с позолотой.
При воссоздании иконостаса использовались рисунки академика Солнцева, а как аналог – иконостас Троицкой надвратной церкви, резьба которого подобна той, что украшала прежний иконостас главного алтаря Великой церкви. Нынешний сосноволиповый иконостас длиной 25 метров и высотой 21 метр состоит из пяти ярусов.